《Microbiology Spectrum》：Dynamics of within-host genomic relatedness and emergence of resistance in serial Mycobacterium avium complex isolates during treatment
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鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex）感染需要长期多药治疗，并可能出现抗菌药物耐药。研究人员应用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）评估患者体内基因组相关性及治疗期间出现的耐药相关突变。对
鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex）感染需要长期多药治疗，并可能出现抗菌药物耐药。研究人员应用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）评估患者体内基因组相关性及治疗期间出现的耐药相关突变。对来自13例重复分离出同一菌种的患者中30株连续分离株（16株鸟分枝杆菌和14株胞内分枝杆菌）的培养种群进行了WGS。基因组相关性按菌种/亚种、序列型（sequence type, ST）和fastBAPS（FB）聚类进行分类。在显示从敏感转为耐药或最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）增加至少两个稀释度的分离株中评估耐药相关突变。在13例患者中，10例（76.9%）显示一致的基因组模式，2例（15.4%）显示不一致的基因组模式并伴有遗传上不同的培养种群，1例（7.7%）在不同时间间隔显示一致和不一致的关系。16株鸟分枝杆菌培养种群属于4个ST（ST112和ST118，占75.0%）和4个FB聚类。14株胞内分枝杆菌培养种群属于4个ST，以ST1109为主（71.4%）。虽然大多数同一ST的培养种群匹配同一FB，但鸟分枝杆菌ST112和ST118及胞内分枝杆菌ST1109各出现在两个FB聚类中。相反，鸟分枝杆菌的三个ST（ST112、ST118和ST1112）属于同一FB。在三例出现克拉霉素耐药性的病例中，两例鉴定出rrl突变（A2058C和A2059G）。在一例中，embC-embA基因间区变异显示变异等位基因频率逐步增加，同时乙胺丁醇MIC升高。WGS提供了两种分析患者体内基因组相关性的方法（ST分配和FB聚类），二者相互补充，并能够纵向检测治疗期间的耐药相关突变。重要性：鸟分枝杆菌复合群肺病通常需要长期多药治疗，在此期间连续培养阳性分离株在患者体内基因组相关性和抗菌药物耐药性方面可能有所不同。区分密切相关的分离株与遗传上不同的分离株并识别新出现的耐药性具有重要临床意义，但仅依靠传统菌种鉴定或序列分型无法可靠实现。在本研究中，对连续鸟分枝杆菌复合群分离株进行全基因组测序（WGS）能够高分辨率评估患者体内基因组相关性。WGS还鉴定出新出现的耐药相关突变，包括在大环内酯类药物治疗期间与高水平克拉霉素耐药相关的获得性rrl突变，以及在含乙胺丁醇治疗期间伴随乙胺丁醇最小抑菌浓度升高的embC-embA基因间区变异。这些发现支持WGS在表征复发性鸟分枝杆菌复合群分离株之间基因组关系和检测治疗期间耐药相关突变出现方面的潜在临床效用。
鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex, MAC）肺病在全球范围内发病率不断上升，25%–45%的患者会发展为难治性疾病。相当一部分患者尽管接受长期联合治疗仍保持培养阳性，这提出了一个临床问题：复发性分离究竟反映持续感染、混合感染还是新菌株再感染。区分这些可能性对治疗决策具有重要意义，但需要将纵向临床和微生物学信息与高分辨率基因分型相结合。全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）能够实现菌株级分辨率并提供抗菌药物耐药机制的深入见解。已有研究提出以20–50个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）作为评估鸟分枝杆菌复合群克隆相关性的阈值，支持WGS作为评估连续分离株间基因组相关性的高分辨率方法。指南推荐的鸟分枝杆菌复合群肺病治疗方案由克拉霉素（clarithromycin, CLR）、乙胺丁醇（ethambutol, EMB）和利福平（rifampicin, RIF）组成，阿米卡星（amikacin, AMK）保留用于难治性病例。然而，长期治疗可能促进耐药性产生，且EMB和RIF的药敏折点尚未建立。抗菌药物敏感性检测受限，因为临床折点仅适用于CLR、AMK、利奈唑胺（linezolid, LZD）和莫西沙星（moxifloxacin, MFX）。同时，基因型方法如GenoType NTM-DR试剂盒仅靶向rrl（与CLR耐药相关）和rrs（与AMK耐药相关）突变。已知的耐药相关基因包括氟喹诺酮类的gyrA/gyrB和LZD的rplC/rplD，但许多突变的临床意义仍不明确。在此背景下，研究人员对治疗期间获得的连续鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare）分离株进行WGS，以（i）在SNP水平分辨率表征患者体内基因组相关性，以及（ii）研究治疗期间获得的耐药相关突变。研究人员开展了以下研究：2020年5月至2022年9月期间收集了244株鸟分枝杆菌和238株胞内分枝杆菌分离株，通过线性探针 assay 进行菌种鉴定，按照CLSI指南在韩国结核病研究所进行CLR、EMB、RIF、AMK、LZD和MFX的药敏检测。MIC检测采用肉汤微量稀释法，使用 twofold 系列药物稀释，37°C孵育7天。在收集的鸟分枝杆菌复合群分离株中，筛选同一菌种两次或以上培养阳性的患者并审查其治疗史。在接受抗菌药物治疗的患者中，对研究期间至少两次线性探针 assay 鉴定为同一菌种的患者的连续分离株进行WGS。对于WGS，取300 μL经线性探针 assay 鉴定为鸟分枝杆菌复合群的BD BACTEC MGIT 7 mL培养物等分试样，传代至3%小川培养基。获得足够生长后，通过擦拭小川培养基表面收集混合细菌生长物，未经单菌落纯化，使用iDetect gDNA Prep Kit for Microbes提取基因组DNA。因此，每个培养物所测序的材料代表从呼吸道标本回收的培养细菌种群而非单菌落克隆，以下称为培养种群。使用TruSeq Nano DNA Sample Preparation Kit制备WGS文库，在Illumina NextSeq仪器上测序300个循环。生物信息学分析方面，确认菌种鉴定和多 locus 序列分型（multi-locus sequence typing, MLST），新序列型提交至PubMLST数据库。进行基于SNP的系统发育分析，包括种群结构推断和成对SNP距离计算。使用fastBAPS（FB）聚类推断种群结构。与代表连续进化分支的SNP系统发育树不同，FB聚类通过分层贝叶斯方法将种群划分为离散的、统计学显著的基因组谱系。对于FB聚类内更高分辨率的系统发育分析，使用Gubbins鉴定并从比对中移除重组区域。使用snp-sites从所得比对中提取变异位点，使用snp-dists计算SNP距离。使用IQ-Tree构建系统发育树，内置模型测试和1,000次超快自举。为检测耐药相关变异，对连续培养种群应用患者体内突变 calling 方法。变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF）定义为给定位置支持变异等位基因的测序 reads 比例。患者体内基因组相关性分类方面，同一患者的连续培养种群根据其患者体内基因组关系进行分类。当共享同一菌种/亚种、ST和FB聚类时定义为一致的基因组模式。对于具有三个或以上培养种群的患者，当在不同连续间隔观察到这些模式时记录一致和不一致关系。在任何这些特征（菌种或亚种、序列型或FB聚类）上不同的培养种群被认为遗传上不同。读段映射、质量控制和种群筛查方面，使用BWA-MEM将 reads 映射到鸟分枝杆菌（CP018019.2）或胞内分枝杆菌（CP003322.1）参考序列，使用SAMtools v1.18处理比对。使用Kraken2 v2.1.2和Bracken v2.8评估分类组成，使用KmerFinder v3.0.2确认菌种身份。至少85% reads 分配给目标菌种的种群被认为未污染。使用VarScan somatic v2.4.6计算VAF。为评估每个培养物代表单一（克隆）种群还是包含多个（多克隆）种群，检查每个样本相对于参考序列的变异位点VAF分布，遵循Moreno-Molina等人的方法并修改：当变异（<90% VAF）位点比例超过20%时定义为多克隆。耐药相关突变方面，在符合以下任一标准的一致基因组模式中分析获得性突变：（i）具有已建立临床折点的抗菌药物（CLR、AMK、LZD和MFX）从敏感转为耐药，或（ii）无已建立折点的抗菌药物（EMB和RIF）在 twofold 系列稀释中MIC增加≥2个稀释度。已建立的耐药相关基因基于已发表证据定义：rrl（CLR）、embB（EMB）、rpoB（RIF）、rrs/eis（AMK）、rplC/rplD/rrl（LZD）和gyrA/gyrB（MFX）。rrl突变通过与大肠杆菌23S rRNA基因比对转换为大肠杆菌编号。研究结果如下：在连续培养回收的62株鸟分枝杆菌（27例患者）和50株胞内分枝杆菌（23例患者）中，来自13例患者的30株分离株（7例患者的16株鸟分枝杆菌和6例患者的14株胞内分枝杆菌）接受抗菌药物治疗并纳入WGS分析。在13例患者中，10例（76.9%）显示一致的基因组模式，2例（15.4%）显示不一致的基因组模式并伴有遗传上不同的培养种群，1例（7.7%）在不同时间间隔显示一致和不一致的关系。16株鸟分枝杆菌培养种群属于4个ST：ST112（6/16，37.5%）、ST118（6/16，37.5%）、ST141（2/16，12.5%）和新ST1112（2/16，12.5%）以及4个FB聚类。一般而言，同一ST的培养种群被分配到同一FB聚类，但观察到两个显著例外：来自不同患者的两个ST112培养种群被分配到不同FB聚类，成对SNP距离为19,126；来自三例患者的四个ST118培养种群也被分配到两个不同FB聚类（FB2和FB4）。相反，鸟分枝杆菌的三个ST（ST112、ST118和ST1112）属于同一FB。在胞内分枝杆菌中，来自6例患者的14株培养种群被分配到4个ST和4个FB。其中ST1109占优势（10/14，71.4%），其余为ST114（2/14，14.3%）、ST1110（1/14，7.1%）和ST1111（1/14，7.1%）。在四例ST1109患者中，三例被分配到FB7，而患者PI11被分配到FB8。值得注意的是，在PI08中，PI08T2被鉴定为胞内分枝杆菌 chimaera 亚种。FB分配反映核心SNP比对的相对种群结构而非绝对成对距离，因此PI08T1和PI08T2尽管属于不同亚种仍被分配到同一FB。总之，7例鸟分枝杆菌患者中5例和6例胞内分枝杆菌患者中5例观察到一致的患者体内基因组模式。PA02和PI08鉴定为不一致模式，而PA04在不同连续间隔显示一致和不一致关系。一致基因组模式中的SNP距离为0–20，不一致基因组模式中>15,000。为评估每个测序培养物是否代表单一群体，检查了所有30个种群的VAF分布。28个为克隆性，2例观察到多克隆性：PI13T1（胞内分枝杆菌亚种群）和PA05T2（亚种群鉴定为鸟分枝杆菌复合群以外的分枝杆菌菌种）。在10例具有一致基因组模式的患者中，5例（PA06、PA07、PI11、PI12和PI13）至少对一种抗菌药物符合耐药筛查标准。在鸟分枝杆菌中，所有初始分离株对CLR敏感。尽管所有7例患者接受了大环内酯类药物治疗不同持续时间，治疗期间仅一例患者PA07检测到CLR耐药。关于AMK，除一株外所有分离株均敏感，随访期间未出现耐药。在胞内分枝杆菌中，两例具有一致基因组模式的患者（PI11和PI13）在治疗期间出现CLR耐药。关于其他药物，PI11是唯一初始分离株对MFX敏感的患者，第二株分离株在含MFX治疗期间获得耐药，但未鉴定出已知的MFX耐药相关突变。此外，对于无已建立折点的药物，观察到三次MIC增加事件：两次为EMB（PI11和PI12），一次为RIF（PI12）。在三例患者（3/5，60.0%）中鉴定出耐药相关突变。在PA07和PI13中，分别在接受AMK+AZM+EMB+RIF和CLR+EMB+RIF治疗后检测到rrl突变，同时转为CLR耐药。在PI11中，接受AZM+EMB+RIF治疗期间鉴定出embCAB locus内的变异，伴随EMB MIC升高。在其余两例（PA06 for LZD和PI12 for EMB和RIF）中未检测到已建立耐药相关基因的变异。在患者PA07中，PA07T1和PA07T2之间给予AMK、AZM、EMB和RIF治疗95天。在完成95天方案后，T2中检测到rrl c.2272A>C（大肠杆菌编号A2058C），CLR MIC从4 μg/mL变为>64 μg/mL。在患者PI13中，出现rrl c.2267A>G（大肠杆菌编号A2059G）， coinciding with MIC从1 μg/mL增至>64 μg/mL。在两例患者中，后续培养种群中突变以高VAF（99.7%–100%）检测到，表明突变等位基因占主导。在患者PI11中，检测到embCAB locus内的三个变异（embA c.-71delA、embB p.D189Y和embB p.N282D）。值得注意的是，embA c.-71delA在含EMB治疗方案期间显示VAF逐步增加（0% → 61.4% → 88.5% → 91.9%），与EMB MIC从8 μg/mL增至32 μg/mL平行。相反，embB p.D189Y从T2到T4以100% VAF检测到，embB p.N282D仅在T2以34.3% VAF检测到，在T3或T4均未检测到。讨论部分总结：据研究人员所知，这是韩国首项使用WGS表征来自个体患者的连续鸟分枝杆菌复合群分离株的研究。研究人员实施了两种分析方法——ST分配和FB聚类，它们依赖根本不同的方法。ST比较少量管家基因座的等位基因并返回离散类别而无相关概率，而FB聚类是基于模型的：它在分层贝叶斯模型下划分核心基因组变异并返回具有隶属概率的聚类分配。尽管FB未改变患者体内基因组相关性（因为每个患者内ST和FB保持一致），但它为鉴定共享同一ST的不同基因组种群提供了额外分辨率：鸟分枝杆菌的两个ST（ST118和ST112）和胞内分枝杆菌的一个ST（ST1109）被分割为两个不同的FB聚类。这一发现证明了MLST单独无法解决的基因组异质性，与先前鸟分枝杆菌复合群种群基因组研究一致。有趣的是，ST112和ST118是鸟分枝杆菌分离株中的优势ST，而ST1109在胞内分枝杆菌中占优势。尽管分离株数量少，这一发现与爱尔兰Walsh等人最近的研究一致。此外，研究人员鉴定出一例患者（PI08）其连续分离株属于不同亚种，PI08T2分离株鉴定为胞内分枝杆菌 chimaera 亚种。考虑到胞内分枝杆菌 chimaera 亚种与从呼吸道样本分离时ATS标准满足负相关，这一发现强调了准确亚种水平鉴定的重要性。基于MLST和FB分析，在三例患者（23.1%）中鉴定出不一致基因组模式。这一比例与先前研究报告的28.6%和24.7%一致。此外，一致对的成对SNP距离为0–20，不一致对>15,000，支持先前提出的≤20–50 SNPs阈值用于评估鸟分枝杆菌复合群克隆相关性。基于VAF的筛查可以说明分枝杆菌种群的更多细节，如PA05T2中非目标分枝杆菌菌种也存在。关于耐药相关突变，在三例出现CLR耐药的患者中两例（PA07和PI13）鉴定出rrl A2058C和A2059G突变（大肠杆菌编号）。相反，PI11分离株出现CLR和MFX耐药但无可识别的耐药相关突变。替代机制可能 contributed to 观察到的耐药表型，特别是ATP结合盒转运蛋白上调可能 contributed to CLR敏感性降低。PI11中鉴定的embC-embA基因间区变异（embA c.-71delA）位于与结核分枝杆菌中通过增加embAB表达导致乙胺丁醇耐药相关的区域。该变异VAF的逐步增加与EMB MIC升高密切平行，提示其在EMB耐药增加中的潜在作用。然而，该变异在胞内分枝杆菌中的功能效应尚未建立，本研究发现未证明因果关系。相反，embB p.D189Y和p.N282D的时间模式与观察到的MIC变化不一致。本研究存在若干局限性：第一，单个呼吸道标本可能无法完全捕捉肺部鸟分枝杆菌复合群种群的空间多样性；第二，并非所有纵向随访期间获得的培养阳性标本都纳入WGS分析；第三，基因组DNA从菌落擦拭而非直接标本提取，可能改变原始呼吸道标本中存在的细菌种群组成。结论部分翻译：基于研究结果，WGS能够详细表征连续鸟分枝杆菌复合群培养种群的患者体内基因组相关性，并纵向监测治疗期间耐药相关基因组变化。MLST与FB聚类之间的不一致突出了全基因组分析提供的额外分辨率，检测到与CLR耐药相关的rrl突变以及伴随EMB MIC升高的embCAB变异变化，证明了基因组耐药监测的潜在临床价值。需要更大规模患者群体的更全面纵向采样研究来阐明患者体内种群动态并验证新观察到的耐药相关变异的临床意义。
