《Microbiology Spectrum》：Pathogen identification and resistance gene expression tests using ASTar remnant bacterial suspension in gram-negative contrived positive blood cultures
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快速病原体鉴定、耐药检测及药敏谱分析可改善抗菌药物处方及相应结局，但流程碎片化会导致效率低下且成本高昂。研究人员评估了一种仅供科研使用（RUO）的方法，即利用常规抗菌药物敏感性试验（AST）产生的ASTar残余细菌悬液，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（M
快速病原体鉴定、耐药检测及药敏谱分析可改善抗菌药物处方及相应结局，但流程碎片化会导致效率低下且成本高昂。研究人员评估了一种仅供科研使用（RUO）的方法，即利用常规抗菌药物敏感性试验（AST）产生的ASTar残余细菌悬液，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）病原体鉴定，以及基于侧向流免疫层析法（LFA）的靶向耐药机制检测。将来自参考菌株库和精选耐药菌株库（CDC1、ARLG2及ATCC3）的革兰阴性菌株（n = 129）模拟接种至血培养瓶中，并使用ASTar BC G-试剂盒（Q-linea AB，瑞典）在ASTar系统中进行处理。在RUO条件下，于ASTar运行启动约1–2 h后收集残余细菌悬液，并使用NG Test CTX-M Multi、NG Test CARBA-5、NG Test Acineto-5 RUO及MALDI-TOF MS进行分析。残余悬液平均（±SD）体积为2,722 μL（±300 μL）。所有样本均获得高置信度MALDI-TOF MS评分（>2.0），其中5份样本初始评分<2.0，经重复检测后得到解决。LFA结果与参考菌株在blaCTX-M阳性/阴性（32/32）及60或61株靶向碳青霉烯酶阳性/阴性分离株方面显示完全一致。对部分样本进行检测以模拟结合ASTar表型结果的反射式工作流程，未影响LFA性能（n = 35；23株肠杆菌目、3株Pseudomonas aeruginosa及9株Acinetobacter baumannii）。与商业多重PCR相比可实现成本节约。这种将约6 h快速表型AST与同批次运行中的鉴定和耐药检测（自仪器启动起1–2 h）或依据ASTar结果可用性进行反射式检测相结合的一体化方法，可能有助于更早获得药敏结果，并为当前工作流程节省成本。
血流感染（BSIs）是临床实践中最严重的细菌感染形式，常为脓毒症的前驱状态，而脓毒症是由宿主对感染反应失调所致器官功能障碍的一种危及生命的疾病。脓毒症全球发病率持续上升，部分原因在于抗菌药物耐药率不断升高，削弱了抗菌治疗疗效。血流感染和脓毒症患者的最佳管理依赖于快速鉴定致病病原体及其抗菌药物敏感性谱。传统病原体鉴定和抗菌药物敏感性试验（AST）工作流程因国家、医疗体系和实验室而异，但通常遵循共同顺序，自血培养采集起平均约60–70 h可获得AST结果，若感染耐药病原体则约需90 h。美国微生物学会近期实践指南推荐快速诊断检测，并配合全面的结果沟通计划，以改善靶向治疗时间（TTT）。快速病原体鉴定平台，包括分子检测，可提供病原体鉴定并检测耐药基因；然而，这些方法通常成本较高，且仅能识别耐药基因的存在，无法可靠预测表型表达。侧向流免疫层析法（LFA）可检测已表达的耐药标志物，作为补充方法可能有助于连接基因型检测与表型表达。因此，分子结果回答的是"耐药基因靶标是否存在？"，而侧向流结果回答的是"目标耐药蛋白/酶在细菌样本中是否可检测到？"。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）因准确性高、单次检测成本低及病原体库广泛，被广泛用于快速病原体鉴定。ASTar（Q-linea AB，瑞典）是一种快速表型AST系统，约6 h即可提供AST结果，与标准治疗AST系统相比可将表型药敏结果时间缩短约36–42 h。在常规样本制备过程中，ASTar在其一次性试剂卡盒内于检测启动约1 h后产生纯化细菌悬液。纯化细菌量通常远超下游AST所需，多余部分在标准流程完成时作为残余物质被丢弃。虽然ASTar系统的预期用途仅限于AST，且未获得欧洲合格认证（CE）标志或美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于病原体鉴定或LFA的样本制备，但该系统产生的残余物质可能为仅供科研使用（RUO）的下游分析应用提供机会，包括超出该系统获批声明范围的MALDI-TOF MS和LFA。本研究评估了利用ASTar残余物质进行MALDI-TOF MS病原体鉴定和基于LFA的耐药检测的可行性。该工作完全在RUO条件下开展，旨在评估ASTar残余细菌悬液并生成基础数据，以支持未来开发针对血流感染和脓毒症全面快速诊断的一体化省时工作流程。此外，与多重PCR等分子方法相比，该方法提供了一种节省成本的替代方案，同时保持高诊断准确性，支持更高效的临床微生物学工作流程。研究人员从美国疾病控制与预防中心与FDA抗菌药物耐药分离株库、抗菌药物耐药领导力组生物样本库及美国典型培养物保藏中心选择了具有可用基因型参考结果的充分表征菌株。分离株库信息用于细菌鉴定和耐药机制。细菌鉴定在Q-linea使用MALDI-TOF MS验证。菌株储存于?80°C。接种前，每株菌在TSA-S平板上传代培养，于35°C ± 2°C孵育18至24 h，并检查生长是否充分、菌落形态及纯度。对每株菌制备0.5麦氏浓度溶液，并在磷酸盐缓冲盐水中经两步稀释30,000倍。取该稀释液150 μL接种至预装9 mL健康人供者血液的bioMérieux BACT/ALERT FA Plus需氧血培养瓶（bioMérieux Sweden AB，M?lndal，瑞典），初始细菌浓度约为20 CFU/mL。加菌培养瓶在bioMérieux BACT/ALERT VIRTUO培养箱中孵育至阳性。ASTar系统（Q-linea AB，瑞典）是一种全自动快速表型AST平台，已获CE-IVDR认证和FDA 510(k)批准，可直接用于阳性血培养。该系统由ASTar仪器和ASTar BC G-试剂盒组成。试剂盒包含两种一次性耗材：含样本制备和AST处理所需全部试剂的卡盒，以及含当前FDA批准面板23种抗菌药物和当前CE-IVDR标记面板24种抗菌药物、覆盖广泛浓度的336孔盘。ASTar可独立于病原体鉴定启动，但病原体鉴定结果必须可用才能创建并导出最终最低抑菌浓度（MIC）结果报告。在确认单一微生物革兰阴性血培养阳性后，将1 mL阳性血培养物直接加载至ASTar卡盒，样本经自动浓度测定和稀释步骤，生成符合欧洲抗菌药物敏感性试验委员会和临床与实验室标准研究所指南的最终细菌接种物。随后接种ASTar盘，卡盒内残留残余细菌悬液。AST随后在抗菌药物面板上进行，使用延时显微成像结合专有算法监测细菌生长，从而确定MIC及相应S/I/R分类。系统样本制备总时间约1 h，自ASTar运行启动约6 h可提供全面AST报告。血培养阳性后，样本按制造商说明加载至ASTar系统。样本制备过程中，在计数和制备标准化接种物之前，自动产生阳离子调节Mueller-Hinton肉汤中的纯化细菌悬液。该悬液细菌浓度反映填充卡盒时阳性血培养中的细菌浓度，并受（i）制备过程中卡盒内潜在进一步生长、（ii）回收率及（iii）六倍稀释因子影响。在RUO方案下，于检测启动约1 h后从ASTar卡盒回收残余细菌悬液。在获批的ASTar工作流程中，一旦ASTar盘成功接种，样本制备卡盒可于检测启动约1 h后从仪器中取出。取出后，卡盒其中一个孔中约有2.7 mL过量/残余纯化细菌悬液可用，可随时用于下游分析。只要相应样本制备位置无需用于后续运行，卡盒内容物可在取出后任意时间收集。研究人员随后将取出的细菌悬液制备用于MALDI-TOF（Bruker Biotyper Sirius MALDI系统）鉴定和/或在适当情况下基于细菌种属进行一种或多种LFA（NG test CTX-M Multi、NG Test CARBA 5、NG Test Acineto-5 RUO；均为NG Biotech，Guipry，法国）。对每种检测（MALDI-TOF或LFA），取600 μL残余细菌悬液等分试样，以12,000 × g离心3 min。小心吸出上清液，在离心管底部保留未扰动的干燥沉淀，用于下游MALDI-TOF或LFA。MALDI-TOF和LFA检测最初在从ASTar样本制备卡盒回收残余悬液后立即进行。此外，部分分离株进行延迟LFA检测，即离心沉淀于4°C–8°C储存6 h后分析。该方法旨在模拟一种潜在实验室工作流程，即根据鉴定和ASTar MIC结果将LFA检测用作快速反射试验。对于MALDI-TOF MS分析，采用直接转移法。简言之，使用无菌牙签将离心沉淀中的细菌物质直接点样至MALDI靶板。随后将MALDI基质溶液直接加至涂片，干燥后使用Bruker Biotyper MALDI系统（IVD文库版本4de4b913-45ba-490e-bcf9-593ebaf6ed46）分析。置信度评分≥2.0视为可接受用于种水平鉴定，这些样本无需重复检测。初始置信度评分<2.0的分离株从储存卡盒中取新等分试样进行重复检测。重复分析时，含剩余残余/过量物质的ASTar卡盒储存于标准细菌培养孵育箱中，这允许悬液进一步生长，可能有助于重跑成功。所有进行重复检测的分离株均获得≥2.0的置信度评分，无需进一步重复检测；因此无需额外样本制备步骤，如甲酸处理。MALDI-TOF MS评分经评估并与参考细菌鉴定结果比较。为制备LFA检测沉淀，遵循每种LFA检测所附使用说明。沉淀重悬于150 μL试剂盒提供的提取缓冲液中。取其中100 μL加至检测卡盒，孵育15 min后判读。为模拟ASTar最终表型AST结果可用后的反射式工作流程，部分样本（n = 26，23株肠杆菌目[ENT]，3株Pseudomonas aeruginosa[PsA]）的沉淀在从仪器和卡盒取出后冷藏储存6 h再进行LFA检测。RUO Acineto-5检测还在9份Acinetobacter baumannii（AcB）样本上测试。此处所有9份样本的细菌物质沉淀均冷藏储存6 h，模拟快速反射检测。检测到的耐药机制的LFA结果与参考细菌基因型比较，计算总体阳性和阴性符合率。成本比较部分，针对低（0.7%碳青霉烯不敏感[Carb NS]肠杆菌目、5.0%超广谱β-内酰胺酶[ESBL]、12.0% Carb NS铜绿假单胞菌-鲍曼不动杆菌）、中（2.0% Carb NS肠杆菌目、12.0% ESBL、20.0% Carb NS铜绿假单胞菌-鲍曼不动杆菌）和高（4.5% Carb NS肠杆菌目、20.0% ESBL、40.0% Carb NS铜绿假单胞菌-鲍曼不动杆菌）耐药率设置，对有和无商业多重检测系统的机构，对碳青霉烯耐药（肠杆菌目、P. aeruginosa/A. baumannii）和ESBL产生（肠杆菌目）的病原体鉴定及耐药标志物存在/表达信息的增量额外成本或成本节约进行建模。ASTar系统成本被排除在模型之外，因为假设在所有使用ASTar进行快速AST的比较中保持不变。分析仅限于增量检测/材料成本，不包括报销或货币化人工操作。结果显示，ASTar残余细菌悬液的下游检测制备简单，手工操作时间<10 min。残余物在标准ASTar AST处理后即可获得，MALDI-TOF MS和LFA运行均可在每样本10 min内从该材料制备。在129份革兰阴性样本中，卡盒取出后每卡盒残余悬液平均（±SD）为2,722 μL（±300 μL）。用于MALDI和/或LFA的残余/过量物质浓度约在3 × 106至7 × 108 CFU/mL之间，95%样本计数大于1 × 107 CFU/mL。快速MALDI鉴定的种或种群分布为76%（98/129）肠杆菌目、16.3%（21/129）P. aeruginosa/A. baumannii、2.3%（3/129）Stenotrophomonas maltophilia（面板外）及1.6%（3/129）Salmonella spp.（面板外）。所有129份样本最终均获得>2.0的高置信度鉴定评分，包括5份初始评分<2.0、经单次点样重复检测后重新获得高置信度评分的样本。卡盒取出后（ASTar启动约1 h后）进行的LFA结果与参考blaCTX-M阳性/阴性（32/32）及所有碳青霉烯酶阳性/阴性类型完全一致，除一份参考OXA-48阳性分离株经重复检测后解决（60/61）。总体阳性符合率为98.9%，总体阴性符合率为100%。对于35份样本子集（23株肠杆菌目、3株P. aeruginosa及9株A. baumannii），在回收残余物质后冷藏储存6 h再进行LFA检测，反射式LFA结果与卡盒取出后直接处理的样本所得结果相同。在成本比较中，模型假设反射式LFA检测包括对碳青霉烯耐药肠杆菌目、P. aeruginosa和A. baumannii使用CARBA-5，对碳青霉烯耐药肠杆菌目使用CARBA-5/CTX-M两种检测。在无综合征分子检测的机构中，假设ASTar系统成本恒定，MALDI-TOF MS和反射式LFA在低至高耐药设置之间的建模增量额外成本（美元）肠杆菌目为1.39至4.15美元，P. aeruginosa/A. baumannii为4.60至17.00美元。在有综合征分子检测的机构中，假设ASTar系统成本恒定，MALDI-TOF MS和反射式LFA在低至高耐药设置之间的建模增量成本节约肠杆菌目为68.62至115.85美元，P. aeruginosa/A. baumannii为65.40至103.00美元。讨论部分指出，血流感染和脓毒症仍是重大临床挑战，部分原因在于其时间敏感性，诊断延迟会延长经验性治疗并延迟抗菌治疗优化。本研究证明了一种RUO工作流程，即ASTar系统常规AST过程中产生、否则将被丢弃的残余细菌悬液可用于MALDI-TOF MS下游病原体鉴定及LFA靶向耐药标志物相关酶检测。该残余物质在所评估数据集中对两种应用均支持稳健性能。全部129份样本均获得高置信度MALDI评分（>2.0），包括一小部分5份初始评分低于阈值但经重复检测获得高置信度评分的样本。同时，LFA结果与参考基因型数据高度一致，包括CTX-M检测完全一致，以及使用NG CARBA-5在肠杆菌目、P. aeruginosa和A. baumannii中靶向碳青霉烯酶（KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48样）检测高度一致。肠杆菌目中一份不一致的OXA-48结果经重复检测后解决。总之，这些发现表明ASTar系统的残余细菌悬液尽管是通常被丢弃的多余物质，仍可能适用于可靠的下游应用。除分析性能外，该方法潜在价值在于其对实验室工作流程和操作瓶颈的影响。虽然快速AST系统已被证明可缩短获得可操作AST结果的时间，但其总体获益可能受上游方案或仪器依赖性的限制，包括及时的病原体鉴定。通过再利用残余物质，这种RUO方法在现有AST运行中结合了早期病原体鉴定和靶向耐药检测，而未引入额外样本制备步骤。MALDI-TOF MS鉴定和LFA检测可在完整AST报告完成前很久启动，手工操作时间极少（<10 min）。该方法可能加速实验室工作流程中病原体信息的可用性，同时减少重复样本处理需求。这对实验室工作流程可能具有重要意义。早期病原体鉴定和靶向耐药标志物检测与全面快速表型AST相结合，可能支持更早获得结果。总体而言，当涉及ASTar时，这有可能实现简化的工作流程，并且是分子方法的实用补充而非直接替代，与综合征分子系统相比可能节省成本。从操作角度看，该方法还解决了若干关键障碍。系统成本仍是诊断仪器采用的主要障碍，而这种RUO方法避免了将额外高复杂性仪器引入工作流程。它同时通过提供无需传代的直接来自血培养的MALDI-TOF MS，减少劳动密集型方案，同时减少血培养基质成分的干扰。重要的是，实验室可根据其操作需求选择不同工作流程方法。MALDI-TOF MS和LFA检测材料可从残余悬液同时制备，额外工作量极少；或者，若需进一步表征，LFA检测可在病原体鉴定后作为反射步骤进行。这种灵活性允许实验室根据当地实践和额外耐药标志物检测的临床相关性调整检测。此外，ASTar自动化处理确保残余物质的可重复生成，最大限度减少手动提取相关的变异性，在人员有限的实验室中具有优势。还观察到处理时间的灵活性，因为无论沉淀制备和检测是在ASTar样本制备后卡盒可用时启动，还是沉淀冷藏6 h后启动，LFA性能均保持不变，表明性能未随时间下降。使用RUO Acineto-5检测的反射式LFA结果（制备后冷藏6 h）也观察到一致性能。解释这些发现时需考虑若干局限性。首先，研究在RUO条件下进行，不代表ASTar系统的获批或预期用途。其次，评估使用含具有充分表征耐药机制的革兰阴性菌株的模拟阳性血培养，因此可能无法完全反映常规临床样本的生物学和操作变异性。尽管ASTar检测可在病原体鉴定可用前启动，但AST和LFA结果均需确认鉴定才能适当解释，尤其是在多微生物样本中。MALDI-TOF MS性能使用单一Bruker Biotyper平台/文库配置评估，可能随其他MALDI仪器、数据库或实验室工作流程而变化。此外，成本分析仅限于增量检测/材料成本，不包括报销或货币化人工操作相关成本。最后，需要使用临床血培养的前瞻性研究来评估常规实验室条件下的性能，并确定对 antimicrobial 优化、有效治疗时间、降阶梯、静脉（IV）至口服转换及患者结局的影响。值得注意的是，MALDI-TOF MS和LFA检测仅代表这种纯化残余细菌悬液应用的兩個例子。尽管超出本研究范围，该材料可能根据特定实验室需求支持额外下游用途。总之，这项RUO评估表明，ASTar残余细菌悬液在常规快速AST工作流程中原本被丢弃，却有潜力用于MALDI-TOF MS病原体鉴定和基于LFA的耐药检测。将约6 h表型AST与同批次运行中的耐药检测或LFA反射检测相结合，减少了对多个系统和样本制备步骤的依赖，可能加速结果获得时间，为现有方法提供成本效益高且操作高效的替代方案。
