多年生黑麦草种子萌发早期对共生Epichlo?内生真菌的转录组响应

《Seeds》：Transcriptomic Responses of Perennial Ryegrass to Resident Epichlo? Endophytes During Early Stages of Seed Germination

摘要：无性型Epichlo?属真菌内生菌与早熟禾亚科（Pooideae）禾草形成互惠共生关系，并通过种子垂直传播。尽管这些共生关系可提升牧草生产性能与持久性，但宿主在种子萌发早期对驻留内生真菌的整体转录响应仍知之甚少。本研究调查了与三种分类学上不同的Epichlo?菌株相关的多年生黑麦草（Lolium perenne）在种子吸胀及幼苗发育早期的转录组变化。将Alto-SE、Alto-NEA12和Alto-NEA11共生组合与不含内生真菌的Alto-WE种子进行比较。在种子吸胀阶段，Alto-SE、Alto-NEA12和Alto-NEA11中分别有2627、2695和3022个宿主基因差异表达，随后在第2天差异表达基因数量急剧减少。基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析表明，差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）主要与转录和RNA加工、基因组维持、分子运输以及防御和胁迫相关反应有关。多个转录因子家族以及与组蛋白修饰、DNA甲基化和染色质重塑相关基因的差异表达揭示了广泛的调控重编程，其中包含共享的和菌株特异性的宿主反应。本研究未进行萌发性能评估和功能验证，且表面消毒设计限制了将内生真菌相关的转录反应与本研究中潜在的处理效应区分开来。尽管如此，这些发现为进一步研究种子介导的内生真菌传播以及成功建立宿主-内生真菌共生体所涉及的分子过程奠定了基础。未来的生理学、组织学和功能学研究将需要确定它们与种子性能和内生真菌传播成功的关系。

多年生黑麦草种子萌发早期对共生Epichlo?内生真菌的转录组响应解读

一、研究背景与科学问题

Epichlo?属无性型真菌内生菌与早熟禾亚科禾草经过数百万年的协同进化，形成了精细调控的互利共生关系。多年生黑麦草（Lolium perenne）是全球温带地区最重要的牧草之一，因其高饲草消化率和快速建植能力而备受重视。该物种的种子生产和商业化对支撑牧场建植和基于饲草的畜牧业生产具有重要经济意义。多年生黑麦草种子的质量受活的、可通过种子传播的Epichlo?内生真菌存在与否的强烈影响。含有低水平活内生真菌的品种，其牧草生产力和持久性均低于含内生真菌的等效品种。因此，多年生黑麦草种子与其相关Epichlo?内生真菌之间的相互作用与种子质量、牧草表现及饲草生产系统的长期可持续性密切相关。由于种子既是宿主也是其驻留真菌共生体的传播载体，萌发是维持宿主-内生真菌关联的关键过渡期。

与多年生黑麦草相关的Epichlo?内生真菌被分为四个分类群：LpTG-1、LpTG-2、LpTG-3和LpTG-4。其中LpTG-2是源自Epichlo? festucae var. lolii与E. typhina种间杂交的异倍体类群，而其他分类群的菌株为单倍体。内生真菌的存在可为宿主禾草提供显著益处，包括增强对干旱、氮磷缺乏等不利环境条件的抗性。此外，Epichlo?物种表现出显著的化学型多样性，通过产生多种次生代谢产物保护植物免受植食性昆虫侵害、赋予病害抗性，并在某些情况下对放牧哺乳动物产生负面影响。作为回报，植物为驻留内生真菌提供栖息场所、营养和繁殖途径。

无性型Epichlo?内生真菌完全依赖通过种子的垂直传播作为其扩散方式。在萌发过程中，内生真菌菌丝定殖于发育中的芽组织细胞间隙，随后与宿主协调生长进入分蘖和生殖组织，从而实现向下一代的传播。与病原真菌不同，互惠型Epichlo?内生真菌不会引发强烈的病害症状或无限制的防御反应。相反，真菌的生长和生物量受到与宿主发育相协调的严格调控，使内生真菌能够在植物的整个生命周期中持续存在。

虽然已有转录组研究鉴定了成熟营养组织和生殖组织中与内生真菌相关的生理、代谢和防御反应变化，但对种子萌发期间宿主的转录响应了解甚少，而正是在这一时期，垂直传播的内生真菌必须保持活力并与发育中的幼苗恢复协调生长。种子萌发涉及响应发育和环境信号的广泛生理和转录重编程。转录因子（Transcription Factors，TFs）和表观遗传调控因子通过协调基因表达、植物防御以及与相关微生物的相互作用参与了这一过程。然而，尽管无性型Epichlo?内生真菌的垂直传播是唯一的传播方式，宿主在萌发启动阶段的全局转录响应尚未得到详细表征。因此，本研究比较了不含内生真菌的多年生黑麦草（Alto-WE）与含有三种分类学上不同的内生真菌菌株（SE、NEA12和NEA11）的种子在种子吸胀和幼苗发育早期的转录组，旨在鉴定共享的和菌株特异性的宿主反应，特别关注富集的生物学通路、转录因子家族以及与组蛋白修饰、染色质重塑和DNA甲基化相关的基因。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了来自Barenbrug New Zealand的新西兰多年生黑麦草品种Alto的不含内生真菌（WE）种子以及含有标准内生真菌（SE）、NEA11和NEA12的种子。所选菌株代表感染多年生黑麦草的不同分类学谱系，并具有多样的生物碱合成谱。SE（LpTG-1）为单倍体内生真菌，产波拉明、洛里特姆和麦角缬氨酸；NEA11（LpTG-2）为异倍体菌株，合成波拉明和麦角缬氨酸；NEA12（LpTG-3）为单倍体菌株，仅产环氧詹氏素。在确认Alto-WE中无内生真菌以及Alto-SE、Alto-NEA12和Alto-NEA11中内生真菌活性后，种子经表面消毒并在湿润无菌滤纸上萌发。在两种时间点（0小时和2天）为每种宿主-内生真菌组合各收获12粒种子并制备4个生物学重复。0小时对应经过3.5小时表面消毒和种子准备过程后的即刻时间点，代表种子萌发的吸胀阶段；2天对应胚根突破种皮阶段。文库使用Agilent SureSelect链特异性RNA文库制备试剂盒构建，并在Illumina HiSeq 3000平台上测序。采用最新的多年生黑麦草基因组组装（含38868个注释蛋白编码基因）作为参考基因组。使用Gydle核程序将高质量读数比对至参考基因组。利用edgeR进行差异表达分析，以log₂倍数变化≥1且p≤0.01为标准筛选差异表达基因（DEGs）。功能分类使用Mercator4在线流程进行，并依据MapMan BIN本体论进行分类。使用Blast2GO Pro进行DEGs注释。KEGG通路和GO富集分析分别针对上调基因和下调基因使用KOBAS 3.0进行。

三、研究结果

3.1 差异基因表达

差异表达分析识别出Alto-SE、Alto-NEA12和Alto-NEA11共生组合在0小时分别有2627、2695和3022个DEGs，在2天分别有513、367和681个DEGs。所有宿主-内生真菌组合中84%-89%的DEGs在0小时检测到，随后在2天急剧减少。热图显示所有三个宿主-内生真菌组合均有两个明显的基因表达阶段。在阶段1（0小时），无内生真菌植物与各宿主-内生真菌组合之间成对比较观察到的动态差异表明，种子萌发期间宿主中迅速触发了主要的转录变化。在阶段2（2天），不到2%的多年生黑麦草转录本在有/无内生真菌种子之间差异表达，表明随着萌发进程，胁迫或防御相关的转录响应减弱。进一步比较鉴定出所有三个宿主-内生真菌组合共有的基因，在0小时共有634个上调基因和357个下调基因，在2天共有13个上调基因和27个下调基因。分析还发现了少数在不同宿主-内生真菌组合中作用不同的基因，其中Alto-SE组合在0小时拥有更多独特基因，表明SE与宿主的相互作用与其他组合相比存在一定差异。

3.2 DEGs的功能分类

鉴于最早的取样点（0小时）是本研究中最具转录动态的阶段，研究人员选择了该时间点进行深入分析。MapMan功能分类显示DEGs与多个功能类别相关，其中“染色质组织”（BinCode 12）、“RNA生物合成”（BC 15）、“RNA加工”（BC 16）、“蛋白质稳态”（BC 19）和“溶质转运”（BC 24）是最过度代表的类别。在与初级代谢相关的类别中，包括光合作用和呼吸作用，观察到下调基因多于上调基因。

3.3 DEGs的GO和KEGG富集分析

KEGG通路分析显示，上调的DEGs在Alto-SE、Alto-NEA12和Alto-NEA11组合中分别富集于14、15和18条主要代谢通路，其中12条通路在所有三个宿主-内生真菌组合中共同显著富集。四个相互关联的通路——RNA转运、剪接体、RNA降解和RNA聚合酶——在所有三个组合中均显著富集。与细胞保护和维持相关的多条通路被鉴定，包括参与植物DNA损伤应答的三个KEGG通路（同源重组、核苷酸切除修复和碱基切除修复），以及自噬通路。赖氨酸降解、ABC转运蛋白、内吞作用和多种植物激素信号网络的富集表明，对内生真菌感染的响应涉及广泛的代谢和信号重编程。相反，多条与胁迫响应和防御相关的通路在所有三个组合中一致地下调，包括内质网中的蛋白质加工、谷胱甘肽代谢和氧化磷酸化。GO富集分析确定了上调DEGs中共同富集的10个GO条目和下调DEGs中共同富集的7个GO条目。

3.4 转录因子和表观遗传修饰

3.4.1 转录因子

在Alto-SE、Alto-NEA12和Alto-NEA11组合中分别鉴定出146、126和165个差异表达的TFs，归类为52个TF家族。Alto-NEA12和Alto-NEA11组合中上调TFs多于下调TFs，而Alto-SE组合中情况相反。在所有三个组合中，有21个TFs共同上调和17个TFs共同下调。与Alto-SE组合相比，Alto-NEA12和Alto-NEA11组合共享更多的上调TFs。总体而言，FAR1（远红光受损反应1）是所有上调TF家族中最丰富的，其他最丰富的上调TF家族包括AP2/ERF-ERF（Apetala2/乙烯响应因子）、C3H、C2H2、B3、MYB_related、B3-ARF、HB-other、MYB、WRKY和GRAS。最常见的下调TF家族包括AP2/ERF-ERF、HSF、bZIP、bHLH、C2C2-GATA、B3、HB-HD-ZIP、MYB、NAC和Trihelix。

3.4.2 表观遗传修饰

与组蛋白修饰、DNA甲基化和染色质重塑相关的基因在DEGs中表现突出，大多数在0小时表达增加。Alto-SE、Alto-NEA12和Alto-NEA11组合中与翻译后组蛋白修饰相关的DEGs数量分别为32、31和35，主要包括组蛋白甲基化和乙酰化相关基因。与DNA甲基化相关的基因数量分别为18、30和28，包括RNA指导的DNA甲基化（RdDM）通路、非RNA依赖性DNA甲基化和ROS1介导的DNA去甲基化通路中的基因。与染色质重塑复合物相关的基因，包括SWI/SNF、ISWI、INO80、SWR1和ALC1复合物，分别有30、31和28个基因差异表达。大约46%的表观遗传调控相关基因在所有三个组合中共享，其余基因表现出菌株相关的表达模式。Alto-SE组合与Alto-NEA12和Alto-NEA11组合共享的基因较少，拥有最多独特的与表观遗传修饰相关的上调和下调基因，并且Alto-NEA12和Alto-NEA11之间大多数基因的表达模式比任一方与Alto-SE之间更为相似。

四、讨论与结论

总结讨论部分： 研究人员讨论了在种子吸胀阶段观察到最大数量DEGs的意义，指出这与种子萌发期间发生的广泛生理和转录重编程一致。0小时后DEGs的急剧减少表明宿主对内生真菌存在的转录响应被迅速调节。研究人员强调，与病原菌诱导大量基因表达变化不同，共生菌引起的宿主转录组变化相对较小，这与先前关于高羊茅中E. coenophiala的研究一致。讨论部分重点阐述了多个富集通路的生物学意义：RNA生物学通路（RNA转运、剪接体、RNA降解和RNA聚合酶）的富集表明宿主在萌发早期经历了广泛的转录和转录后重编程；DNA损伤修复通路（同源重组、核苷酸切除修复和碱基切除修复）的激活可能代表一种有利于建立互利共生的宿主响应，与某些植物-病原菌相互作用中这些通路被抑制形成对比；内质网中蛋白质加工通路的下调，特别是多个热休克蛋白（HSPs）的下调，表明宿主植物将内生真菌识别为共生体而非病原体；谷胱甘肽代谢和氧化磷酸化等活性氧（ROS）代谢相关通路的下调也支持了这一观点。研究人员还指出，与SE相比，NEA11和NEA12组合之间更高的TF共享以及更相似的基因表达模式可能与菌株的进化历史和地理分布有关：SE样菌株通常被称为常见或野生型内生真菌，在全球范围内分布，与宿主具有悠久的共进化历史，而NEA11和NEA12是新型内生真菌菌株，地理分布有限。

翻译研究结论部分： 本转录组分析研究了相对于不含内生真菌的多年生黑麦草，三种分类学上不同的Epichlo?菌株在种子吸胀和种子萌发早期阶段的宿主响应。在0小时观察到最多的DEGs，表明最强的内生真菌相关宿主转录响应发生在种子吸胀期间。2天时DEGs的显著减少表明该响应随萌发进程被快速调节。本研究鉴定了与若干生理过程相关的转录变化，包括内质网中蛋白质加工和网格蛋白介导的内吞作用，这些过程此前在Lolium-Epichlo?共生体中尚未得到深入研究，从而确定了与宿主-内生真菌相互作用相关的候选分子过程。此外，KEGG和GO富集分析中发现植物防御响应相关基因既有激活也有抑制，表明与Epichlo?内生真菌存在相关的防御响应调控复杂，凸显了Lolium-Epichlo?共生的复杂性。属于AP2/ERF-ERF、FAR1和HSF家族的TFs是对内生真菌存在最敏感的转录因子。对表观遗传调控相关基因的分析鉴定了可能有助于调控宿主对内生真菌存在响应的转录变化。本研究因缺乏候选基因的功能验证和萌发性能评估，以及无法将潜在的表面消毒相关效应与内生真菌相关的转录响应区分开来而存在局限性。这些发现，包括与TFs和表观遗传调控相关的核心与非核心基因的鉴定，为进一步的生理学、组织学和功能学研究提供了基础，以确立其生物学意义及其与种子性能和内生真菌传播的关系。需要对本研究鉴定的关键基因进行实验验证以确认它们在宿主-Epichlo?相互作用中的作用。此外，能够分别考虑表面消毒效应和更广泛的种子相关微生物组的实验设计，将有助于区分表面消毒相关响应与内生真菌相关响应。将转录组分析与生理学和组织学评估（包括萌发率、活力指数、幼苗建植性状和组织水平观察）相结合，将为观察到的基因表达模式的生物学意义提供进一步的见解。