《Microbiology Spectrum》：Evaluation of point-of-care testing (POCT) for blood-borne infections in forensic autopsy specimens
编辑推荐：
基于侧向流免疫层析（LFIA）的即时检验（POCT）用于病毒抗原和抗体检测，能够实现对血液传播病毒感染的快速筛查，在法医尸检场景中可能具有特殊价值，因为该场景下死者生前病史不完整且侵入性操作增加了职业暴露风险。然而，其在死后标本中的性能尚不明确。本研究评估了基
基于侧向流免疫层析（LFIA）的即时检验（POCT）用于病毒抗原和抗体检测，能够实现对血液传播病毒感染的快速筛查，在法医尸检场景中可能具有特殊价值，因为该场景下死者生前病史不完整且侵入性操作增加了职业暴露风险。然而，其在死后标本中的性能尚不明确。本研究评估了基于LFIA的POCT在尸检标本中检测人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）的适用性，重点关注死后分解及以实体器官组织替代血液的情况。研究人员采用LFIA和定量聚合酶链反应（qPCR）对309例尸检案件的血液、肝脏和脾脏标本进行了分析。通过总体符合率、阳性符合率和阴性符合率以及Cohen's kappa系数（κ）评估一致性。按标本类型和分解状态比较阳性率。LFIA与qPCR的一致性因标志物和标本类型而异，血液中HIV和HCV抗体检测呈高度一致，而肝脏和脾脏中一致性较低。新鲜标本的LFIA阳性率通常高于分解标本。在符合预设qPCR阳性标准的标本中，LFIA阳性标本的病毒载量倾向于高于LFIA阴性标本，其中肝脏HBV达到统计学显著性，血液HBV和肝脏HCV呈现相似但未达显著性的趋势。基于LFIA的POCT可作为死后场景中的初步筛查工具，尤其是在血液标本可用时。然而，阴性结果不能排除感染——特别是在低病毒载量或高度分解的情况下——应通过分子检测加以确认。
血液传播病毒感染，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV），通过接触感染性血液和组织对医护人员和法医人员构成重大职业风险。尸检环境代表尤为高风险的环境：解剖和标本处理不可避免地涉及与潜在感染性物质的直接接触，且送检尸体的生前病史往往不可靠，难以及时识别感染风险。因此，快速可靠地鉴定感染状态对于该环境下的有效感染控制至关重要。目前已有多種实验室方法可用于检测血液传播病毒感染，每种方法在死后场景中各有优劣。定量聚合酶链反应（qPCR）通过直接检测病毒核酸提供高分析灵敏度和特异性，但需要专业设备、 trained人员及较长周转时间，限制了其用于即时风险评估的能力。酶联免疫吸附试验（ELISA）是广泛用于抗原和抗体检测的常规实验室血清学方法，但其在死后标本中的适用性受死后生化变化制约。溶血和蛋白质降解可损害病毒抗原和宿主抗体的完整性，降低免疫学方法在死后条件下的可靠性。即时检验（POCT）通常基于侧向流免疫层析（LFIA），提供了实用的替代方案：可在数分钟内实现病毒抗原或抗体的快速定性检测，无需专业基础设施，已在临床和现场环境中广泛用作筛查工具。与ELISA相比，基于LFIA的POCT可能对溶血或降解标本具有更好的耐受性，因为其定性侧向流形式不依赖精确的光密度测量，且对血红蛋白或其他降解产物的背景干扰不太敏感。然而，这一潜在优势尚未在死后标本中得到系统验证。由于LFIA和qPCR靶向根本不同的生物标志物——抗原或抗体与病毒核酸——不一致结果可能源于分析靶标和检测窗口的差异，且LFIA性能可能进一步受抗原稳定性及非标准标本中宿主免疫反应完整性的影响。除方法学考量外，死后标本还带来不同于临床样本的额外挑战。进行性分解涉及溶血、蛋白质降解和微生物活动，可损害病毒组分和宿主来源标志物的完整性。在高度分解或大量失血的情况下，常规血液采样往往不可行，需要使用肝脏或脾脏等替代标本来源。尽管既往研究已在法医尸检人群的死后血液中检测血液传播病毒感染，但这些研究主要局限于血清学方法，未系统比较LFIA与分子检测在多种标本类型或分解状态下的表现。因此，关于LFIA在非血液死后标本中的性能以及分解如何影响与分子方法一致性的数据仍然有限。本研究评估了LFIA相对于qPCR在法医尸检标本中检测HIV、HBV和HCV的比较性能。具体而言，研究人员评估了：（i）LFIA与qPCR结果之间的一致性水平；（ii）检测率按标本类型的变化；（iii）分解对检测一致性的影响。研究人员还检查了病毒载量与LFIA可检测性之间的关系，以识别可能影响死后场景中检测性能的因素。综上，这些发现旨在为法医实践中的标本选择和感染风险评估提供实用指导。
材料与方法部分，本研究纳入2019年7月至2024年12月期间在首尔国立大学医学院法医鉴定办公室进行的309例法医尸检案件。239例获取了血液标本。其余70例无法采血，主要由于高度分解（67例），其余归因于严重出血（2例）和主动脉瘤破裂（1例）。为评估潜在替代标本，额外采集并分析了213份肝脏和38份脾脏标本。23例获得全部三种标本类型，120例可获得血液和肝脏标本，15例可获得肝脏和脾脏标本。分解状态在尸检时基于预设宏观标准判定，包括皮肤变色、表皮滑脱、腹部膨隆和气体形成，这些是常用的死后分解指标。该评估在LFIA和qPCR之前进行，确保对检测结果设盲。无上述表现的病例归类为新鲜，出现一项或多项特征的归类为分解。这些标准在所有病例中一致应用。
LFIA分析使用Standard HIV 1/2 Ab 3-Line和Standard HCV Ab试剂盒（SD BIOSENSOR，韩国水原）以及Bioline HBsAg和Bioline Anti-HBs试剂盒（Abbott Laboratories，美国伊利诺伊州Abbott Park）。根据制造商规格，使用生前样本报告的灵敏度和特异性分别为：HIV Ab 99.75%和99.91%，HCV Ab 99.77%和100%，HBsAg 100%和100%，Anti-HBs 91.67%和98.89%。由于基质组成和分析物稳定性差异，这些值可能不直接适用于死后标本。所有标本尽可能在尸检后立即检测。当无法在尸检室内检测时，标本运送至实验室，?20°C储存最多约2小时并于当日检测。剩余标本?20°C存档保存。按照制造商指南，血液标本以3,000 rpm离心30分钟获取血浆。若因死后溶血无法分离血浆，则用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水将全血1:3稀释。该稀释足以降低血红蛋白引起的背景变色，使对照线和检测线可清晰区分。血液样本随后按制造商说明处理。肝脏组织样本（150 mg）用手术刀手动切碎为小碎片，悬浮于DEPC处理水中，以3,000 rpm离心30分钟；未使用机械匀浆器或化学裂解试剂。所得上清液用于检测，HIV Ab和HCV Ab检测加样20 μL，HBsAg和anti-HBs检测加样100 μL。脾脏标本处理方式相同，但脾实质柔软且切碎后易于分散，离心后可直接获得清晰上清液，无需DEPC处理水悬浮。检测结果在加样后15–20分钟按制造商指南判读。仅当对照线出现时检测才视为有效。对照线和检测线均可见时判为阳性，仅对照线出现时判为阴性。对照线未出现或20分钟后出现条带则归类为无效。为确保可靠性，LFIA条带结果由三名研究人员独立判读，对临床病史、分解状态和标本类型设盲。判读者之间不一致或结果无效（即对照线缺失或20分钟后条带出现）时进行重复检测。所有LFIA分析在qPCR之前进行，确保对qPCR结果设盲。
qPCR分析方面，由于LFIA和qPCR靶向不同的生物标志物——病毒抗原或抗体与核酸—— neither方法可作为另一方的确定性参考标准；因此qPCR被用作评估与LFIA一致性的实用参考方法。未进行ELISA等常规血清学检测，因为死后溶血和蛋白质降解已知会严重损害其在尸检标本中的可靠性。病毒DNA和RNA从200 μL血液或50 mg组织中使用AllEx Viral DNA/RNA Kit（GeneAll Biotechnology，韩国首尔）按制造商说明提取，最终洗脱体积100 μL。使用GeneProof Diagnostic PCR kits for HIV-1、HCV和HBV（GeneProof，捷克布尔诺）在CFX96 Touch Real-Time PCR System（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州Hercules）上进行qPCR病毒核酸检测和定量。总反应体积50 μL，包括20 μL预混液和30 μL提取核酸或校准品。扩增程序遵循制造商方案：HIV-1和HCV 42°C逆转录15分钟（HBV为37°C初始孵育2分钟），95°C初始变性10分钟，随后45个循环的95°C变性5秒、60°C退火40秒、72°C延伸20秒。阳性由仪器软件根据FAM通道实时荧光扩增曲线及HEX/JOE通道内参扩增自动判定，按制造商判读算法执行；制造商未规定固定Ct cutoff值。每反应包含内参以监测PCR抑制。HIV-2未评估，因其在韩国流行率极低。qPCR阳性定义为基于制造商报告的GeneProof试剂盒检测限：HIV 98.6 IU/mL（55.2 copies/mL），HCV 53.5 IU/mL，HBV 37.0 IU/mL，因为这些检测无经过验证的死后阳性阈值。可检测信号低于这些阈值的标本在阳性判定、一致性分析和病毒载量比较中归类为qPCR阴性。
统计分析方面，分析聚焦于方法间一致性而非诊断准确性。一致性使用2×2列联表的总体符合率（OPA）、阳性符合率（PPA）和阴性符合率（NPA）量化，按每种病毒和标本类型分别计算。点估计值列于表中；关键比较的95% Wilson评分置信区间（CIs）在结果中报告。LFIA与qPCR结果间的一致性进一步使用Cohen's kappa系数（κ）评估，解释标准为：<0.00（差），0.00–0.20（轻微），0.21–0.40（一般），0.41–0.60（中等），0.61–0.80（高度），0.81–1.00（几乎完美）。κ值低于0表示观察一致性低于随机期望，解释为差一致性。Fisher精确检验用于比较新鲜与分解标本间的检测率。双侧P值<0.05视为统计学显著。在有记录的既往临床诊断病例中，LFIA和qPCR结果进行描述性比较。所有统计分析使用Microsoft Excel 2019（Microsoft Corp.，美国华盛顿州Redmond）和R软件版本4.2.0（R Foundation for Statistical Computing，奥地利维也纳）进行。此外，在qPCR阳性标本中，比较LFIA阳性和LFIA阴性组间的定量病毒载量值，以评估LFIA可检测性是否与病毒载量相关。由于定量值非正态分布，组间比较使用Mann–Whitney U检验。鉴于可用于血液HBV和肝脏HCV比较的qPCR阳性病例数量有限，这两项分析被视为探索性；肝脏HBV比较纳入的qPCR阳性病例数远多于血液HBV和肝脏HCV比较。病毒载量值进行log10转换用于可视化。
结果部分，研究人群和标本特征：309例尸检案件平均年龄55.9 ± 15.1岁，男性占76.1%。分解状态方面，新鲜标本占血液的87.9%、肝脏的55.4%和脾脏的44.7%。LFIA和qPCR跨标本类型的总体检测率：LFIA在7.9%的血液样本（19/239，95% CI：5.1%–12.1%）、14.6%的肝脏样本（31/213，95% CI：10.4%–19.9%）和23.7%的脾脏样本（9/38，95% CI：13.0%–39.2%）中检测到至少一种病毒标志物。相比之下，qPCR阳性率在血液中为4.2%（10/239，95% CI：2.3%–7.5%），肝脏中为24.4%（52/213，95% CI：19.1%–30.6%），脾脏中为2.6%（1/38，95% CI：0.5%–13.5%）。值得注意的是，LFIA在脾脏标本中显示最高阳性率，而qPCR在肝脏组织中显示最高检测率。按标本类型和检测方法的病毒特异性检测模式：HIV方面，LFIA在血液中检测到1例（0.4%）阳性，肝脏中10例（4.7%），而qPCR在2份（0.8%）血液样本中检测到HIV，肝脏和脾脏中均未检测到。肝脏和脾脏标本中LFIA与qPCR之间未发现重叠阳性病例。HCV方面，LFIA在血液中鉴定5例（2.1%）阳性，肝脏中6例（2.8%），脾脏中2例（5.3%）。qPCR检测到3份（1.3%）血液阳性样本和7份（3.3%）肝脏阳性样本，脾脏中无阳性。HBV方面，LFIA在4份（1.7%）血液样本中检测到HBsAg，19份（8.9%）肝脏样本，6份（15.8%）脾脏样本。Anti-HBs在10份（4.2%）血液标本、4份（1.9%）肝脏标本和3份（7.9%）脾脏标本中检测到。相比之下，qPCR在6份（2.5%）血液样本、46份（21.6%）肝脏样本和1份（2.6%）脾脏样本中检测到HBV DNA。肝脏组织显示qPCR检测率显著高于LFIA。LFIA与qPCR按标本类型和病毒标志物的一致性：在有记录感染史的病例中，LFIA和qPCR结果总体一致；然而在部分病例中观察到显著差异。在一例有记录的HIV感染史病例中，LFIA在血液和肝脏标本中均检测到HIV抗体，而qPCR仅在血液中检测到HIV RNA。在另一例有HCV感染史病例中，LFIA在血液、肝脏和脾脏中抗-HCV抗体均为阳性，而qPCR未检测到HCV RNA。在三例确诊HBV感染病例中，HBsAg在血液或肝脏中经LFIA和qPCR均为阳性，而anti-HBs经LFIA在所有病例中均为阴性。值得注意的是，在一例中LFIA肝脏标本结果为阴性，另一例因分解导致无血液仅对肝脏进行了检测。LFIA与qPCR的一致性因病毒标志物（此处定义为各检测评估的特定抗原、抗体或核酸靶标）和组织类型而异；基于κ的解释表明，超越随机的一致性往往低于OPA单独提示的水平。HIV方面，血液标本显示高OPA（99.6%）和高度κ一致性（κ = 0.665），表明LFIA与qPCR之间良好一致性。肝脏和脾脏组织中因缺乏qPCR阳性病例无法有意义评估一致性。HCV方面，血液样本显示高OPA（99.2%）和高度κ一致性（κ = 0.746）。肝脏标本中，尽管OPA仍相对较高（96.7%），但κ值（0.445）表明中等一致性，提示超越随机的一致性有限。脾脏组织中因缺乏qPCR阳性病例无法评估一致性。HBV方面，OPA和κ值在检测标志物和组织类型间显示显著差异。血液样本中，HBsAg显示高OPA（98.3%）和中等κ一致性（κ = 0.592）。相比之下，肝脏标本中HBsAg（75.1%，κ = 0.067）和anti-HBs（79.3%，κ = 0.089）均显示较低OPA和仅轻微κ一致性，表明尽管OPA中等偏高，超越随机的一致性极小。脾脏标本同样显示不一致的OPA和普遍较差κ一致性。在所有病毒中，NPA consistently高，而PPA因标本类型和病毒标志物而异。例如血液标本中，HBsAg的LFIA对qPCR显示PPA为50.0%（95% CI：18.8%–81.2%），NPA为99.6%（95% CI：97.6%–99.9%）。分解对检测率和一致性的影响：血液标本中LFIA阳性——HIV Ab 0.5%、HCV Ab 2.4%、HBsAg 1.9%、anti-HBs 4.8%——仅在新鲜标本中观察到，分解标本中无阳性。qPCR同样主要在新鲜标本中显示阳性——HIV 1.0%、HCV 1.4%、HBV 2.4%——而分解样本中仅检测到HBV（3.4%）。肝脏标本中，LFIA检测的HBsAg阳性在新鲜样本中（12.7%）高于分解样本（4.2%），而anti-HBs阳性在分解肝脏组织中（3.2%）高于新鲜组织（0.8%）。qPCR肝脏组织分析显示新鲜（22.2%）和分解（21.1%）样本中HBV DNA检测率均显著高于LFIA结果。值得注意的是，LFIA在8.5%的新鲜肝脏样本中检测到HIV抗体，而qPCR无肝脏标本HIV阳性。脾脏标本中，LFIA在11.8%新鲜样本中检测到HCV抗体，28.6%分解样本中检测到HBsAg，5.9%新鲜和9.5%分解样本中检测到anti-HBs。相比之下，qPCR仅在4.8%分解脾脏标本中检测到HBV DNA。Fisher精确检验显示新鲜与分解标本间仅LFIA肝脏HIV抗体（8.5% vs 0.0%，P = 0.003）和LFIA脾脏HBsAg（0.0% vs 28.6%，P = 0.024）达统计学显著差异。其他比较均未达统计学显著性，尤其是血液标本中。一致性指标因分解状态和病毒标志物而异。分解血液样本中，qPCR阳性病例的稀少或缺失限制了有意义的一致性比较，尽管高OPA值主要由一致的阴性结果驱动。相比之下，肝脏标本——尤其是HCV——显示无论分解状态如何一致性相对稳定。qPCR病毒载量与LFIA结果的关联：在符合预设qPCR阳性标准的标本中，LFIA阳性样本的病毒载量倾向于高于LFIA阴性样本。在6份HBV阳性血液标本中，LFIA阳性组（n = 3）中位病毒载量为791.5 IU/mL，LFIA阴性组（n = 3）为362.9 IU/mL（P = 0.400）。在46份HBV阳性肝脏标本中，LFIA阳性组（n = 6）中位值为574,825 IU/mL，LFIA阴性组（n = 40）为1,972.5 IU/mL，显示显著差异（P = 0.001）。在7份HCV阳性肝脏标本中，LFIA阳性组（n = 3）中位病毒载量为1,624,500 IU/mL，LFIA阴性组（n = 4）为177.1 IU/mL（P = 0.114）。对于其他组织-病毒组合，因缺乏符合qPCR阳性标准的标本或LFIA阳性样本数量不足以进行有意义比较，无法进行统计分析。值得注意的是，发现两例不一致病例，LFIA阴性但qPCR病毒载量高：一例血液标本HIV（36,400 IU/mL）和一例脾脏标本HBV（9,505 IU/mL）。这些发现表明LFIA阴性结果可能不能可靠排除高水平病毒血症。
讨论部分，本研究评估了LFIA在死后标本中检测HIV、HCV和HBV的适用性，发现LFIA与qPCR之间的一致性因标本类型、分解状态和病毒载量而异。尽管观察到LFIA与qPCR结果间的差异，这些发现为解释LFIA结果提供了实用指导。本研究中检测的阳性率与韩国既往报告的流行病学数据广泛一致，韩国HIV、HCV和HBV患病率估计分别约为0.02%–0.03%、0.6%–0.8%和2%–3%，与其他国家基于法医尸检的研究报告的类似血清阳性率模式一致。尽管该比较受尸检人群与一般人群差异及anti-HBs阳性反映既往免疫而非活动性感染的限制，这些发现表明本研究中观察到的阳性率模式与既往报告广泛一致。快速免疫层析检测在非临床环境中的诊断准确性此前已在大规模研究中评估，为在类似挑战性环境如法医尸检场景中解释LFIA结果提供了背景。在符合预设qPCR阳性标准的标本中，LFIA阳性样本的病毒载量倾向于高于LFIA阴性样本，尽管该模式在所有标志物-标本组合中并不统一。该关联仅在肝脏标本HBsAg中达到统计学显著性（P = 0.001），支持该特定抗原-组织组合的病毒载量依赖性可检测性。对于血液HBV和肝脏HCV，观察到相似方向趋势但未达统计学显著性，可能反映qPCR阳性病例数量有限；这些比较应解释为探索性而非验证性。该关系对HBsAg最为直接可解释，HBsAg为抗原标志物，其LFIA检测可能追踪循环抗原浓度。对于本研究中评估的抗体标志物（HIV Ab、HCV Ab和anti-HBs），LFIA阳性可能反映既往暴露、免疫状态或抗原/抗体持续存在而非同时病毒载量，目前数据不支持将HBsAg-肝脏关联扩展至这些标志物。这些发现与抗原和抗体检测相比核酸检测方法固有灵敏度局限一致，但不应推广为本研究中评估的所有LFIA检测均表现统一病毒载量依赖性行为的证据。标本类型是检测性能的另一主要决定因素。血液标本是大多数诊断检测的标准样本类型，本研究中使用的LFIA同样基于血液标本开发。然而，鉴于法医环境中遇到的实际挑战——如严重出血或死后分解导致血液可得性不足——本研究还调查了替代组织标本作为潜在替代物。因此，血液样本显示LFIA与qPCR间最高OPA，支持其作为死后病毒检测首选标本。相比之下，肝脏中LFIA与qPCR一致性显著低于血液，尤其是HBV和HCV。肝脏标本中观察到的较高qPCR检测率不太可能反映检测性能差异，而是HBV和HCV的嗜肝性，优先定位至肝细胞。本研究中观察到的不一致HCV Ab阳性/RNA阴性病例可能反映多种情况，包括自发性或治疗诱导的病毒清除伴持续血清阳性、低于qPCR检测阈值的低水平病毒血症、死后RNA降解或LFIA假阳性结果。由于大多数病例缺乏生前临床数据，这些可能性无法区分。靶标稳定性和死后降解差异也可能导致肝脏标本中LFIA与qPCR低一致性。病毒核酸在死后环境中通常比抗原蛋白更稳定，使qPCR即使在降解标本中仍相对稳健，而LFIA依赖抗原-抗体相互作用，死后蛋白质降解可能损害该相互作用。ELISA同样依赖抗原-抗体相互作用但需要更严格样本质量，预期对死后降解更敏感，因此本研究中未进行。这些发现表明肝脏组织可在血液不可用时作为实用替代，但非血液标本的LFIA阴性结果应谨慎解释。分解状态进一步影响检测性能。按分解状态比较一致性常受分解标本中qPCR阳性病例数量少或缺失的限制，尤其是血液样本。这些发现与既往研究一致，表明病毒核酸和抗体可在死后血液样本中随时间持续存在。然而，其可检测性可能受死后变化影响；宿主来源蛋白包括抗体和抗原比病毒核酸更易受分解影响。相比之下，肝脏中HBV的qPCR检测在新鲜和分解标本间保持相似，可能归因于HBV共价闭合环状DNA在肝细胞核内的相对稳定性。这些发现突出LFIA在分解标本中的局限性，并强调此类病例中分子确认的必要性。综上，这些结果提示若干实践考量。首先，血液应优先作为LFIA的主要标本。其次，替代组织在考虑病毒组织嗜性选择标本类型时可能提供额外诊断价值，尤其是分子检测；然而这些标本的LFIA结果应谨慎解释。第三，LFIA阴性结果不能排除感染，尤其是在低病毒载量或高度分解病例中，当临床或法医有指征时应随后进行分子检测。本研究存在若干局限性。第一，LFIA试剂盒最初开发用于活体患者，未专门验证用于死后应用。第二，某些亚组分析尤其是脾脏标本受小样本量限制，降低统计效能。因此，脾脏标本的一致性分析应相当谨慎解释，视为探索性而非结论性。第三，分解状态使用宏观标准评估而无定量评分或组织病理学确认，可能引入变异性。第四，详细病史获取受法律限制，无法确定性评估灵敏度和特异性。此外，由于LFIA和qPCR靶向不同生物标志物，诊断准确性的直接估计固有受限，结果应解释为一致性而非诊断灵敏度或特异性。此外，死后标本可能含PCR抑制剂影响qPCR结果，抗病毒治疗等生前因素可能影响病毒载量水平。制造商指定的分析灵敏度阈值用于qPCR阳性判定，虽在缺乏验证死后cutoff时必要，但本身可能导致病毒载量接近这些阈值的标本中LFIA/qPCR不一致，可能低估低病毒载量病例的真实一致性。最后，仅评估了选定LFIA试剂盒，不同平台性能可能不同。总之，快速免疫层析POCT可作为死后场景中选定血液传播病毒感染标志物的初步筛查工具，尤其是在血液标本可用时。然而，与qPCR的一致性因标志物、标本类型、分解状态和病毒载量而显著变化。LFIA阴性结果不应用于排除感染风险，尤其是血液不可用或标本显示高度分解时。这些情况下分子确认检测仍然必要。
