《Microbiology Spectrum》：In vitro efficacy of synthetic antimicrobial peptide SET-M33 against poultry isolates with diverse antimicrobial resistance phenotypes
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抗菌药物耐药性（AMR）是一个具有重大影响的One Health问题。其驱动因素之一是人用和动物生产系统中抗生素的广泛使用，尽管家禽养殖中抗生素使用受到法规限制，抗菌药物耐药性仍是一项重大挑战。因此，动物面临更难治疗疾病的风险更高，并作为耐药性储库发挥作用，凸
抗菌药物耐药性（AMR）是一个具有重大影响的One Health问题。其驱动因素之一是人用和动物生产系统中抗生素的广泛使用，尽管家禽养殖中抗生素使用受到法规限制，抗菌药物耐药性仍是一项重大挑战。因此，动物面临更难治疗疾病的风险更高，并作为耐药性储库发挥作用，凸显了对替代抗菌策略的需求。为此，抗菌肽（AMPs）因其广谱活性和较低的诱导耐药倾向而成为有前景的候选物。然而，AMPs对家禽病原体尤其是多重耐药菌株的有效性在很大程度上尚不清楚。本研究评估了SET-M33——一种合成四分支AMP——对四种家禽临床相关病原体的效果，即Escherichia coli、Salmonella enterica、Enterococcus faecalis和Enterococcus cecorum。利用141株现场分离菌株，研究人员发现SET-M33在低微摩尔浓度下广泛抑制细菌生长（革兰阴性菌和革兰阳性菌的中位最低抑菌浓度分别为2.5和5 μM），包括多重耐药分离株。为考察SET-M33对宿主细胞的潜在影响，研究人员建立了使用鸡肠道类器官的体外共培养系统。研究发现SET-M33在类器官-微生物共培养中保持抗菌活性，且所用浓度可维持宿主细胞活力。这些发现表明SET-M33作为抗家禽病原体新型抗菌剂的潜力。
抗菌药物耐药性（AMR）是微生物进化的自然结果，但抗生素的广泛使用加速了耐药菌的出现和传播，构成全球健康威胁。家禽生产系统是AMR循环的关键界面，尽管欧盟已实施限制抗生素使用的法规，耐药菌仍在养殖场中普遍存在，表明仅靠法规措施不足以控制AMR，需要开发具有新型作用机制的抗菌剂。抗菌肽（AMPs）因其多模式作用机制和广谱活性成为有前景的候选物。本研究旨在评估合成AMP SET-M33对家禽临床相关病原体——大肠杆菌（Escherichia coli）、肠道沙门菌（Salmonella enterica）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和塞氏肠球菌（Enterococcus cecorum）的潜在替代抗菌效果。SET-M33最初通过随机噬菌体展示文库针对大肠杆菌筛选鉴定，随后优化为四分支结构以增强抗菌特性。此前研究已证明SET-M33在人类健康相关感染模型中的治疗潜力，但其对家禽相关病原体尤其是耐药菌株的有效性及对宿主的潜在影响尚不清楚。研究人员采用双管齐下的体外方法：首先测定SET-M33对141株大肠杆菌、肠道沙门菌、粪肠球菌和塞氏肠球菌现场菌株的体外活性；其次利用鸡肠道类器官感染模型测定SET-M33在宿主细胞存在下的抗菌活性。数据表明SET-M33在低微摩尔浓度下广泛抑制这些分离株的体外生长，包括对多类常规抗生素耐药的分离株；在类器官-微生物共培养中，SET-M33在不损害宿主活力的浓度下有效抑制大多数测试分离株的病原体生长。本研究凸显了AMPs在应对家禽生产中的抗菌药物耐药性和制定更广泛的One Health导向缓解策略方面的潜力。
研究人员为开展本研究主要采用以下关键技术方法：通过肉汤微量稀释法测定141株禽源现场分离株（来源于西班牙东北部，由加泰罗尼亚和阿拉贡家禽卫生中心提供）对常规抗生素及SET-M33的最低抑菌浓度（MIC）；利用鸡空肠类器官（来源于23日龄Ross 308肉鸡）建立3D类器官培养及类器官来源的2D单层细胞模型；通过CellTiter-Glo检测和跨上皮电阻（TEER）测量评估SET-M33的细胞毒性和上皮屏障完整性；建立类器官-病原体共培养感染模型评估SET-M33在宿主细胞存在下的抗菌效果。
结果部分：（1）家禽菌株的抗菌药物耐药性（AMR）谱分析：研究人员对85株革兰阴性菌和56株革兰阳性菌分别进行了15种和12种抗生素的MIC测定，发现绝大多数菌株对至少一种测试抗生素耐药（革兰阴性菌78/85，革兰阳性菌49/56），部分菌株最多携带10种耐药性。SET-M33的MIC普遍处于低微摩尔范围（低于10 μM），革兰阳性菌尤其是粪肠球菌的MIC值偏高，仅2株粪肠球菌在最高测试浓度10 μM下仍能生长。（2）多重耐药（MDR）状态与SET-M33敏感性之间的关系：通过比较MDR与非MDR菌株的SET-M33 MIC分布，发现无论革兰阴性菌还是革兰阳性菌，MDR状态与SET-M33敏感性之间均无关联（P值分别为0.68和0.39），按菌种或按单个抗生素耐药性分类分析亦未发现关联，表明菌株携带的常规抗生素耐药性不影响其对SET-M33的敏感性。（3）SET-M33在类器官-病原体共培养中的抗菌活性：研究人员建立了96孔板格式的高通量类器官来源单层细胞感染模型，发现SET-M33在最高3 μM浓度下维持宿主细胞活力和上皮屏障功能，对四种参考菌株具有高度日间可重复性。在12株革兰阴性测试菌株中，10株经SET-M33处理后集落形成单位（CFU）数下降数个数量级，其中6株在高剂量下CFU计数低于接种量2个数量级以上，提示杀菌效应；仅1株肠道沙门菌Enteritidis和1株鼠伤寒沙门菌未受影响。结果表明SET-M33在宿主细胞兼容浓度下对大多数测试病原体分离株有效。
讨论部分：尽管欧洲家禽养殖中抗生素消费量近年显著下降，AMR细菌仍频繁检出，需要多方面策略应对。本研究数据表明SET-M33对MDR分离株保持活性，MDR与非MDR菌株间SET-M33敏感性无差异，提示其活性不受菌株携带的AMR基因影响。文献表明AMR不一定与AMPs敏感性降低相关，MDR甚至可能与AMPs的附带敏感性相关。SET-M33对达托霉素耐药菌株仍保持活性，尽管两者均通过破坏细菌细胞膜发挥抗菌作用，但结构不同（达托霉素为脂肽，SET-M33为四分支阳离子肽），确切作用机制可能不同。黏菌素耐药机制涉及细胞表面净负电荷降低，可能对阳离子AMPs具有相关性，但本研究中唯一的黏菌素耐药鼠伤寒沙门菌株对SET-M33的MIC与黏菌素敏感菌株相似。SET-M33在高体外剂量下对宿主细胞具有毒性，限制了其可用浓度范围。与先前报道的支气管上皮单层EC50约20 μM相比，本类器官系统中SET-M33的细胞毒性EC50约为4 μM，提示基于单一或永生化细胞类型的简化体外模型可能低估AMPs的细胞毒性潜力，类器官更高的生理复杂性（多种细胞类型和更代表性的细胞间相互作用）可能反映其更高敏感性。本研究存在若干局限性：耐药谱仅进行了表型评估；未评估长期暴露后MIC变化及获得性耐药；宿主反应评估主要限于细胞毒性和上皮屏障完整性；未测试对宿主黏附或侵袭性细菌群体的效果。总之，本研究证明SET-M33在体外对家禽来源的多种肠道病原体高度有效，不仅对MDR分离株和对其他AMPs耐药的分离株有效，而且在宿主兼容浓度下对类器官-病原体共培养同样有效，支持其作为新型抗菌剂的进一步研究。
