一种基于外周血单核细胞DNA甲基化的分层工具，用于评估食管鳞状细胞癌的风险

《Cell Reports Medicine》：A peripheral blood mononuclear cell DNA methylation-based risk stratification tool for esophageal squamous cell carcinoma

**要点：**
- PBMC DNA甲基化改变可能作为食管鳞状细胞癌（ESCC）检测的生物标志物。
- ESCCseeker整合了8个DNA甲基化位点（DMPs）以及年龄、性别和血清标记物，用于评估ESCC风险。
- 在一个包含1,026人的前瞻性队列研究中，ESCCseeker避免了83%的不必要的内镜检查。
- ESCCseeker可以作为一种可靠的术前分诊工具，用于ESCC的筛查。

**摘要：**
早期检测食管鳞状细胞癌对于提高生存率至关重要，但依赖内镜检查限制了大规模筛查的可行性。我们开发了ESCCseeker，这是一种基于外周血单核细胞DNA甲基化的微创风险分层工具。在中国进行的一项两阶段多中心研究中，全基因组分析确定了ESCC患者和对照组之间的显著甲基化差异。在开发和验证队列中，机器学习模型整合了8个差异甲基化位点与年龄、性别、SCC-Ag和CYFRA21-1等因素。ESCCseeker表现出出色的性能（AUC：训练集0.987，测试集0.966，验证集0.943），优于传统生物标志物。在一个前瞻性多中心队列中，预定义的临界值将患者分为低风险和高风险组。将内镜检查仅限于高风险个体可减少内镜检查次数，从25.02次降至4.78次，避免了83%的不必要程序，同时保持超过90%的检测敏感性。这些发现表明ESCCseeker是一种可靠的术前分诊工具，能够减少不必要的侵入性检查，并优先处理高风险个体。该试验已在中国临床试验注册系统（ChiCTR2500095967）中注册。

**引言：**
食管癌（EC）是一种主要的胃肠道恶性肿瘤，是全球第十一大常见癌症，也是癌症相关死亡率的第七大原因。中国承受着不成比例的负担，占全球病例的43.8%和EC相关死亡的42.1%。食管鳞状细胞癌（ESCC）是最主要的组织学亚型，占EC病例的近90%，发病率在东亚和非洲部分地区最高。预后仍然较差，美国的5年总生存率仅为18.5%，中国为36.9%。然而，预后很大程度上取决于诊断阶段。早期ESCC的5年生存率接近90%，但大多数患者在出现吞咽困难和体重减轻等症状时已处于晚期。这种诊断延迟导致了ESCC持续的高死亡率，突显了有效早期检测策略的迫切需求。目前，内镜检查是ESCC筛查和诊断的金标准。大规模研究已经证实了内镜检查在降低ESCC发病率和死亡率方面的价值。例如，一项基于社区的研究报告称，内镜检查分别降低了19%和18%的发病率和死亡率。因此，日本和韩国等国家实施了全国范围内的内镜筛查计划，显著提高了早期检测和生存率。然而，在资源有限的环境中，包括中国，由于高风险人群庞大、合格内镜医师数量有限以及初级医疗保健能力不足，广泛的内镜筛查受到限制。此外，由于只有约1%-3%的人口患有ESCC，无差别筛查会导致大量资源浪费。因此，迫切需要准确的风险分层工具来预先筛选高风险个体，优化内镜资源的分配，并提高人群筛查项目的成本效益。

**DNA甲基化：**
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，参与发育、分化和肿瘤发生。异常DNA甲基化是癌症早期且常见的事件，导致基因表达失调。血浆游离DNA（cfDNA）甲基化标志物显示出诊断潜力。Zhang等人报告了三个血浆甲基化标志物，其在区分EC患者和健康对照组方面的敏感性为85.5%，特异性为95.3%。与cfDNA相比，外周血单核细胞（PBMCs）更丰富且易于检测，使其成为生物标志物开发的理想选择。多项研究已将PBMC DNA甲基化改变与癌症风险联系起来。我们之前的工作已经验证了PBMC DNA甲基化在乳腺癌、结直肠癌和肺癌中的诊断潜力，表明其在动态疾病监测和风险分层方面的前景。然而，目前尚无系统研究表征ESCC中的PBMC DNA甲基化谱型或评估其在早期检测中的价值。

**研究方法：**
为解决这一空白，我们在中国进行了一项全国性的多中心前瞻性研究，以评估PBMC DNA甲基化作为ESCC的术前分诊工具。研究分为两个步骤：（1）使用Infinium MethylationEPIC BeadChip（HM935k）进行全基因组甲基化分析，以识别PBMC来源的甲基化特征，然后通过靶向亚硫酸氢盐测序验证候选标志物，并构建机器学习检测模型；（2）在一个独立的前瞻性队列中评估该模型在风险分层中的临床应用，该队列通过内镜确认。

**结果：**
**ESCC患者中全面的PBMC DNA甲基化图谱：**
研究设计、选择策略和基线患者特征总结见图1和S1以及表S1。首先，我们在42名ESCC患者和30名对照组（性别和年龄均平衡，p > 0.05）中进行了微阵列分析，以表征ESCC中的PBMC DNA甲基化图谱。基于所有位点的主成分分析（PCA）有效区分了ESCC和对照组，显示出ESCC中PBMC甲基组的显著重塑（图2A）。我们鉴定了742个显著差异甲基化位点（DMPs）（Benjamini-Hochberg [BH]校正p < 0.05，|Δβ| ≥ 0.06），包括89个高甲基化和653个低甲基化DMPs（图2B和S2A）。DMPs分布在所有染色体上，表明存在全基因组范围内的改变（图2C）。基因组注释显示DMPs在基因组岛和基因体内的富集（图2D）。与先前的研究一致，我们在ESCC中观察到转录起始位点±1,500 bp范围内的主要低甲基化现象（图2E）。

**候选DNA甲基化标志物的识别：**
使用72个样本的935K微阵列数据识别了候选DNA甲基化标志物。在432个样本中开发了一个预测模型，并在238个样本的独立队列中进行了验证。在1,026名参与者中进一步评估了该模型在风险分层中的性能。

**基于EBMCs的全基因组DNA甲基化分析（发现队列）：**
**临床应用：**
- 在ESCC患者中进行了全面的PBMC DNA甲基化分析。
- 通过微阵列分析鉴定了72个样本的935K数据中的候选DNA甲基化标志物，并在432个样本中开发了一个预测模型，在238个样本的独立队列中进行了验证。
- 在1,026名参与者中进一步评估了该模型在风险分层中的临床应用。

**ESCC进展过程中的DNA甲基化动态：**
我们对DMPs进行了无监督层次聚类，将它们分为六个不同的趋势簇，并通过均匀流形近似和投影（UMAP）进行了可视化（图2F）。第5簇的DMPs（例如，ZNF468启动子中的cg15721243和RHOU启动子中的cg23239813）表现出渐进性甲基化，而第1簇和第6簇的DMPs（例如，TNNT1启动子中的cg10218876和FBXO3启动子中的cg02239453）在ESCC发生和进展过程中表现出渐进性低甲基化。这些DMPs的通路富集分析显示它们参与了免疫相关过程，包括T细胞受体信号通路、造血细胞谱系和B细胞受体信号通路（图S2B）。尽管富集程度不具有统计学意义，但这些免疫通路反映了ESCC对循环免疫细胞的系统影响。

**ESCCseeker分类器的构建：**
从发现阶段鉴定的742个DMPs中，我们选择了50个最具代表性的标志物（p值最低）进行进一步评估。调整细胞类型比例后（EpiDISH和EWAS；图S2C），所有50个CpG仍然具有显著性（p < 0.05；表S2）。赢者诅咒校正显示效应大小仅有轻微减弱（表S2），确认了它们之间的稳健关联。基于这些DMPs的无监督层次聚类有效区分了ESCC患者和对照组（图S3A）。

**模型验证：**
为了克服基于阵列分析的高成本和有限的临床适用性，我们使用TBS验证了候选DMPs。成功为50个DMPs中的48个设计了引物，其中2个因扩增不良而被排除。在101名ESCC患者和100名对照组的独立队列中的验证确认了38个与ESCC显著相关的DMPs（FDR < 0.05，方向性与微阵列结果一致），并且不受年龄和性别的影响（表S2）。随后，LASSO回归确定了9个DMPs进行进一步分析。将这些DMPs映射到发现集的簇中（表S3），显示大多数属于第2簇和第4簇，表明该模型捕捉到了低甲基化介导的激活。

**最终诊断模型：**
我们使用这些甲基化标志物在151名ESCC患者和152名对照组的扩展训练集中构建了一个XGBoost模型（图3A），命名为ESCCseeker。为了提高临床实用性并减少特征冗余，我们将验证过的标志物与人口统计变量（年龄和性别）和血清肿瘤标志物（CEA、SCC-Ag和CYFRA21-1）相结合。LASSO回归应用于最初的14个特征，包括9个DMPs、年龄、性别、SCC-Ag和CYFRA21-1。这一过程保留了8个DMPs以及年龄、性别、SCC-Ag和CYFRA21-1，同时排除了CEA和一个DMP（cg18657707）（图S3B和S4A）。我们应用了4种机器学习算法来构建ESCC的诊断模型。基于XGBoost的模型表现出优越的性能（AUC = 0.987；Delong’s检验，所有p < 0.05；图S4B）。因此，我们采用了基于XGBoost的分类器ESCCseeker作为最终诊断模型。根据平均绝对SHAP值，cg03396260和cg20184330对模型的预测能力贡献最大（图3B）。

**结论：**
- ESCCseeker在训练集、测试集和验证集中区分ESCC的准确率分别为95%、92%和91%（图S4C–S4F）。
- 它始终优于传统生物标志物（CEA、SCC-Ag和CYFRA21-1）和9-Methy（训练集AUC：0.987；测试集AUC：0.966；验证集AUC：0.943）。
- ESCCseeker的敏感性也始终高于TM-combine（三种血清肿瘤标志物的组合：CYFRA21-1、CEA和SCC-Ag；详见STAR方法）和9-Methy（训练集：94.70%；测试集：95.38%；验证集：91.49%）（图3A和3C–3I）。
- 在验证集中，ESCCseeker在区分ESCC和HGIN方面表现出强大性能（AUC：0.889，敏感性：86.67%），优于TM-combine和9-Methy（图S4G和S4H；表S4）。对于ESCC/HGIN与对照组的分类，该模型实现了0.917的AUC和89.13的敏感性，再次超越了TM-combine和9-Methy（图S4I和S4J；表S4）。在其他常见恶性肿瘤的特异性分析中，ESCCseeker有效地区分了ESCC与其他癌症（总体AUC：0.917），特别是在乳腺癌（AUC：0.926，特异性：83.33%）、肺癌（AUC：0.927，特异性：84.00%）和肝细胞癌（AUC：0.898，特异性：77.42%）方面表现优异（图3J、3K和S4K）。为了提高统计功效，将训练集、测试集和验证集合并为一个组合集。在此组合集中进行的多变量逻辑回归确认了ESCCseeker在检测ESCC时独立于临床协变量（图S4L）。PCA显示三个队列之间没有明显的批次效应（图S5A和S5B），这证明了直接合并的合理性。

ESCCseeker测试的特点
ESCCseeker在三个数据集中表现出高且一致的分类性能，PCA未检测到批次效应（图S5A和S5B）。因此，在组合队列中进行了亚组分析以增强统计功效。早期检测ESCC对于及时干预和根治性切除至关重要。因此，我们评估了ESCCseeker在组合集中对传统血清肿瘤标志物（CEA、SCC-Ag和CYFRA21-1）的诊断性能。在组合集中，ESCCseeker的AUC超过0.950，包括I期的0.953和II期的0.980，显著优于传统标志物。其敏感性分别为89.33%（I期）和94.64%（II期），而传统标志物的敏感性≤20%（图4A；表S5）。为进一步解决传统标志物在检测小病灶方面的局限性，我们检查了ESCC≤3cm的患者。ESCCseeker显示出高区分能力，AUC为0.954，敏感性为87.01%，远超传统标志物（图4A；表S5）。

图4 ESCCseeker与传统血清生物标志物在不同亚型中的诊断性能

图注：
(A) 在组合集（训练/测试/验证集）中，ESCCseeker与传统血清蛋白生物标志物（CEA、SCC-Ag和CYFRA21-1）在不同ESCC亚型中的AUC（95% CI）、敏感性（95% CI）和特异性（95% CI）进行比较。误差条代表95%置信区间。
(B) 按性别和年龄亚组划分的ESCCseeker ROC曲线。
(C) 按性别和年龄亚组划分的ESCCseeker得分分布。盒形图表示四分位数范围（IQR，Q1–Q3），盒内的线表示中位数， whiskers延伸到1.5 × IQR范围内的最小值和最大值。每个点代表一个样本（n = 527）。虚线水平线表示临界值。统计显著性使用Wilcoxon检验确定。***p < 0.001。
(D) 按性别和年龄亚组划分的ESCCseeker与传统血清生物标志物（CEA和CYFRA21-1）的敏感性（95% CI）。误差条代表95%置信区间。
(E) 在组合队列中，ESCCseeker区分血清生物标志物阴性ESCC患者与对照组的比例的ROC曲线。
(F) 在组合队列中，血清生物标志物阴性ESCC患者与对照组中ESCCseeker得分的分布。盒形图表示四分位数范围（IQR，Q1–Q3），盒内的线表示中位数， whiskers延伸到1.5 × IQR范围内的最小值和最大值。每个点代表一个样本（n = 527）。虚线水平线表示临界值。统计显著性使用Wilcoxon检验确定。***p < 0.001。
(G) 在组合队列中，血清生物标志物阴性ESCC患者中ESCCseeker的敏感性和特异性。CEA：癌胚抗原；SCC-Ag：鳞状细胞癌抗原；CYFRA21-1：细胞角蛋白19片段抗原21-1；ESCC：食管鳞状细胞癌；LN：淋巴结转移。

为了进一步评估ESCCseeker在人口亚组中的诊断性能，我们按性别和年龄进行了分层分析。如图4B所示，该模型在所有亚组中始终表现出优异且稳定的区分能力，AUC值超过0.960。大多数亚组的敏感性超过90%（≤60岁亚组为84.93%），明显优于传统血清生物标志物（<20%）（图4C和4D）。我们进一步探讨了ESCCseeker在传统血清标志物检测阴性的患者中的诊断效用。在定义为CEA(-)、SCC-Ag(-)、CYFRA21-1(-)和TM-combine(-)的亚组中，该模型保持了高性能，AUC超过0.960，敏感性超过90%（图4E–4G）。这些发现突显了ESCCseeker在不同临床亚群中有效区分的能力，支持其作为ESCC风险分层的可靠有效工具的潜力。

ESCCseeker的风险分层性能
为了前瞻性地验证ESCCseeker的风险分层性能，我们在2024年6月至2025年2月期间，从八家医院招募了1,253名40–75岁的患者，这些患者根据标准临床指征安排进行内镜检查。从1,059名参与者中收集了PBMCs用于8-DMP面板分析，并获取血清样本以测量传统肿瘤标志物（CEA、SCC-Ag和CYFRA21-1）。由于PBMC DNA不足或测序质量控制失败，33名参与者被排除在外。因此，共有1,026名患者接受了内镜检查并纳入最终分析。参考标准基于内镜发现和随访病理检查确定（图5A）。在招募的参与者中，没有报告与血液采集程序相关的严重不良事件或未预期的检测相关不良事件。

图5 ESCCseeker风险分层和预测性能的前瞻性队列评估
图注：
(A) 风险分层阶段的工作流程。
(B) 预测风险组与观察到的临床终点之间的关联。
(C) 前瞻性队列中各组ESCCseeker得分的分布。盒形图表示四分位数范围（IQR，Q1–Q3），盒内的线表示中位数， whiskers延伸到1.5 × IQR范围内的最小值和最大值。每个点代表一个样本（健康，n = 820；良性，n = 131；LGIN，n = 34；HGIN，n = 24；ESCC，n = 17）。虚线水平线表示临界值。统计显著性使用Wilcoxon检验确定。***p < 0.001。
(D) 左：HGIN和ESCC中ESCCseeker与TM-combine的敏感性（95% CI）。误差条代表95%置信区间。右：高级别病变病例中ESCCseeker与TM-combine的敏感性。圆内的每个块代表一个高级别病变（ESCC/HGIN，n = 41）。黄色块表示ESCCseeker或TM-combine正确识别的病变，而灰色块表示漏诊的病例。
(E) 沉积图显示1,026名参与者属于TM-combine风险组或ESCCseeker风险组的情况。
(F) 条形图显示按TM-combine（左侧两个条形：阴性和阳性）和ESCCseeker（右侧两个条形：低风险和高风险）分层的ESCC、HGIN、LGIN和健康病例的数量。对于每个分类，两个条形之和等于队列中的总ESCC（n = 17）和HGIN（n = 24）病例数。ESCC：食管鳞状细胞癌；HGIN：高级别上皮内瘤变；LGIN：低级别上皮内瘤变。

根据预先定义的0.5的ESCCseeker临界值，参与者被分为低风险组（≤0.5，n = 849）和高风险组（>0.5，n = 177）（图5B和5C）。高风险组中高级别病变的患病率显著较高，占20.9%（37/177，95% CI：15.53%–27.51%，包括16例ESCC和21例HGIN）。相比之下，低风险组仅有4例高级别病变（1例ESCC和3例HGIN）。值得注意的是，ESCCseeker漏诊的单一ESCC病例是一个极早期肿瘤（T1a-LPM，<3 cm），这可能解释了其低风险得分。根据tm-combine，参与者被分为tm-combine(-)（所有标志物阴性，n = 883）和tm-combine(+)（任何标志物阳性，n = 143）组。tm-combine(+)组中高级别病变的患病率为6.99%（10/143，95% CI：3.7%–12.54%，包括6例ESCC和4例HGIN）。值得注意的是，tm-combine(-)组漏诊了超过一半的高级别病变，其中31例（11例ESCC和20例HGIN）随后通过内镜诊断（图5D–5F；表S6）。ESCCseeker在富集高级别病变方面显著优于tm-combine。

ESCCseeker成功识别了41例高级别病变中的37例（敏感性90.24%，95% CI：76.89%–96.70%）和17例ESCC病例中的16例（敏感性94.12%，95% CI：71.08%–100%）（图5D）。这包括9例I期癌症中的8例（敏感性88.89%，95% CI：54.33%–100%），5例II期癌症中的5例（敏感性100%，95% CI：51.09%–100%），以及3例III期癌症中的3例（敏感性100%，95% CI：38.25%–100%）。高级别病变的阳性预测值为20.90%（95% CI：15.53%–27.51%），ESCC的阳性预测值为9.04%（95% CI：5.55%–14.26%）。在985名没有高级别病变的参与者中，特异性为85.79%（95% CI：83.46%–87.83%），阴性预测值（NPV）为99.53%（95% CI：98.75%–99.86%）。在951名没有肿瘤的参与者中，特异性为87.28%（95% CI：85.00%–89.25%，NPV为97.76%（95% CI：96.51%–98.59%）（表S6）。

我们进一步证明了ESCCseeker显著提高了内镜推荐的效率。在整个队列中，高级别病变的预测试概率为4.00%（ESCC为1.66%）。使用ESCCseeker进行风险分层后，低风险组中高级别病变的post-test概率降至0.47%（ESCC为0.12%），而在高风险组中升至20.90%（ESCC为9.04%）（图6A）。因此，将高风险个体转诊进行内镜检查（筛查人群的17%）将需要进行内镜检查的人数从25.02减少到4.78，避免了83%的不必要程序，同时保持了高级别病变（90.24%）和ESCC（94.12%）的高检测率（表S6）。与未分层筛查相比，这种针对性转诊策略的相对风险比提高了5.45倍。

图6 ESCCseeker的风险分层和临床管理效用
图注：
(A) 计算了在不同食管病变类型（HGIN和ESCC）中ESCCseeker的预测试和post测试概率估计。黑点代表预测试概率（总体患病率）。蓝点显示post测试检测概率（高风险组中的患病率）。橙点显示post测试剩余风险（低风险组中的患病率）。误差条代表95%置信区间。
(B) Sankey图显示了ESCCseeker拦截后的癌症阶段变化。每种情况下的发病率百分比显示在括号中。
(C) 不同筛查依从率（20%、40%、60%和80%）下诊断的ESCC病例的阶段分布。
(D) 随着筛查参与率的增加，每100,000名可筛查个体中ESCC死亡率降低的变化。
(E) 在ESCCseeker基于风险分层之前和之后的内镜资源利用情况比较。ESCC：食管鳞状细胞癌；HGIN：高级别上皮内瘤变。

为了提高统计功效，我们汇总了研究中的所有ESCC患者的数据，计算了ESCCseeker在不同TNM阶段的检测率（图S6A），并将其输入拦截模型（见STAR方法）。我们发现，在理想筛查情况下，I期癌症的比例可以从15.51%增加到93.07%，同时死亡率降低了36.16%（图6B和S6B）。随着筛查依从率的提高，I期诊断的比例显著上升，死亡率相应降低（图6C和6D）。基于这些发现，我们提出了一种优化后的临床路径，其中低风险个体根据标准临床实践进行常规监测，而高风险个体直接进行内镜检查（图6E）。为了支持临床决策，我们还开发了一个在线计算平台，提供实时风险评估和内镜推荐指导（图S7，见STAR方法）。

讨论
在这项研究中，我们开发并验证了一个机器学习模型ESCCseeker，该模型在独立验证队列中显示出对ESCC和非ESCC参与者之间的良好区分能力。在一个基于医院的前瞻性内镜筛查项目中，ESCCseeker有效识别了高风险个体，同时将需要内镜检查的人数减少了大约83%，从而最小化不必要的程序。这些发现突显了ESCCseeker作为有效的预内镜风险分层工具，用于指导内镜推荐。ESCC是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其生存率低主要是由于晚期诊断，这阻碍了根治性切除。因此，早期检测至关重要，然而患者很少在可治疗阶段出现症状或可靠的生物标志物，使得内镜检查成为当前的筛查金标准。在中国，大规模内镜筛查受到资源限制、程序相关风险、心理负担和经济成本的制约。已经提出了基于问卷的风险模型，结合了人口统计和生活方式因素，但其区分能力仍然有限（AUC 0.70–0.80；PPV约为39/100,000）。相比之下，液体活检提供了一种客观、微创的方法来检测癌症特异性改变。之前的基于血浆的甲基化模型，如刘等人开发的模型，报告的AUC约为0.82。在这项研究中，ESCCseeker获得了更高的AUC值，这支持了它作为内镜前分流工具的潜力，以指导内镜检查的转诊。我们的研究通过系统地验证PBMC衍生的DNA甲基化标记物，推进了这一领域的发展。全基因组分析显示，在ESCC中转录起始位点附近存在全局性的CpG低甲基化现象，这与之前在结直肠癌和乳腺癌中的观察结果一致。由于DNA甲基化调节基因在启动子、增强子和5?UTR中的表达，这些改变可能会影响ESCC进展过程中的免疫反应。通路富集分析支持了这一假设，显示出与免疫相关的通路（如T细胞受体信号通路）显著富集。利用一个可解释的机器学习框架，我们识别出了八个稳定的甲基化标记物，包括cg05914150（位于Cluster 3中的PIK3R1）和cg20184330（位于Cluster 4中的MIDEAS）。值得注意的是，这些标记物与我们之前在乳腺癌、结直肠癌和肺癌研究中识别出的标记物没有重叠，这可能表明观察到的甲基化改变具有一定程度的ESCC特异性，尽管还需要进一步验证。PIK3R1是PI3K信号传导的一个关键调节因子，并且与抗肿瘤免疫有关。MIDEAS编码一个参与转录负调控的转录辅抑制因子，在乳腺癌中表达不同。这些结果突显了PBMC表观遗传失调在ESCC发病机制中的作用及其作为生物标志物开发的实用性。ESCCseeker将PBMC甲基化标记物与人口统计因素（年龄和性别）以及传统的肿瘤生物标志物（SCC-Ag和CYFRA21-1）相结合。这种多维方法利用互补信息来提高诊断准确性。我们的模型再现了已知的风险模式——随着年龄的增长和男性患病率的增加——同时强调了SCC-Ag和CYFRA21-1作为预筛查生物标志物的附加价值。在临床实践中，我们提出了一种两步策略：首先使用ESCCseeker进行初步风险分层，然后对高风险个体进行确认性内镜检查。高特异性可以减少假阳性和不必要的程序，而高敏感性则确保了真正病例的检测，从而优化了资源分配。在一个前瞻性队列中，ESCCseeker检测到了90.24%的高级病变和94.12%的ESCC病例，阴性预测值（NPV）为99.53%，这使我们有信心排除低风险个体。这些结果优于基于问卷的模型，并且与基于细胞学的方法相当或超过后者，而且还有更高的患者依从性优势。这种阳性预测值比例超过食管癌（EC）的群体发病率可能是由于该队列来源于医院的机会性筛查，而不是社区组织的筛查。99.53%的NPV使医生能够通过可靠的检测排除“真阴性”结果，有效减少了“不确定病例”，从而避免了过度治疗，优于当前的临床评估模型。我们的研究与基于机器学习的自动海绵细胞学筛查在ESCC和食管胃交界处腺癌方面的表现相当。然而，与基于细胞学的检查相比，血液检测预计将显著提高患者的依从性，这对于早期癌症检测策略的成功至关重要。我们认为将ESCCseeker与内镜检查相结合是中国人群中ESCC风险分层的一种有前景的方法。根据ESCCseeker的结果，可以实施分层管理：（1）低风险个体按照标准临床实践进行常规监测；（2）高风险个体立即被转诊进行内镜检查。我们强调，最佳监测间隔需要通过纵向随访数据进一步研究。这样的风险分层方法可以在减轻医疗负担的同时提高早期ESCC的检测率。总之，我们证明了PBMC衍生的DNA甲基化改变为ESCC风险分层提供了坚实的基础。通过整合临床和分子数据，ESCCseeker相比现有方法具有更好的诊断性能和成本效益，支持它作为一个实用且可扩展的工具来指导内镜检查的转诊。

研究的局限性需要考虑几个限制。首先，相对较小的样本量和在机器学习中使用多个特征可能会导致过拟合。一个更大的发现队列可能会产生具有更高统计能力的不同标记物面板。尽管在独立队列中得到了验证，但性能指标周围的宽置信区间表明存在剩余的不确定性。需要大规模随机试验来确认其临床效用。其次，所有队列都是中国人，这可能限制了其普遍性。此外，我们的研究没有包括免疫相关疾病的患者。未来在更多样化的人群中进行验证，包括那些患有免疫相关疾病的人群，对于全面评估我们的发现是必要的。因此，我们目前正在设计一个前瞻性真实世界队列研究，专门包括患有常见免疫相关疾病（例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和慢性炎症性疾病）的患者，以直接评估ESCCseeker在这些人群中的特异性。此外，尽管我们的发现在内镜指示的队列中很有前景，但所需的内镜检查减少数量和预期的群体水平效益可能不会直接适用于疾病发病率较低的人群。需要前瞻性基于社区的研究来验证这些估计。最后，由于缺乏随访数据，无法评估纵向性能和最佳重新筛查间隔。长期前瞻性研究对于完善临床应用至关重要。

资源可用性
主要联系人：如需进一步信息和资源，请联系主要联系人Lutao Du（[e-mail]）。

材料可用性
本研究没有生成新的独特试剂。

数据和代码可用性
• 本研究中生成的微阵列数据和靶向亚硫酸氢盐测序数据已存放在GEO数据库中，访问编号分别为GSE302955、GSE349469和GSE349476。这些数据在发表之日起是公开可用的。
• 本文报告的所有其他数据将在收到请求时由主要联系人提供。请求必须包括详细的实验方案和分析计划，并须在数据传输前获得机构批准。
• 所有代码已存放在Zenodo上，网址为https://doi.org/10.5281/zenodo.21337420，在发表之日起也是公开可用的。
• 任何重新分析本文报告的数据所需的额外信息都可以向主要联系人请求获得。

致谢
我们衷心感谢自愿参与研究的参与者、帮助研究过程的工作人员和同事，以及提供指导的研究人员。这项工作得到了中国国家重点研发计划[2023YFC2413200]、山东省重点研发计划[2022CXGC202507]、国家自然科学基金（编号82272412、82472357和82327802]、山东省自然科学基金（编号ZR2023JQ027、ZR2024MH107、ZR2022QH130和ZR2025QC1655）、山东省泰山学者计划（编号tstp20250751）、山东大学优秀中青年学者计划和山东大学跨学科培养计划（2022JC002）的支持。

作者贡献
P.L.、J.L.、C.W.和L.D.共同构思和设计了这项研究；P.L.、Y.X.、Y.Z.和Q.Q.协调项目管理和整合研究资源；P.L.、Y.X.、Y.Z.和Q.Q.平等参与了实验实施、数据分析和手稿起草，并直接访问和验证了基础数据；D.T.、J.L.、C.W.和L.D.分析了数据并修订了手稿；S.Z.、Z.Z.、C.G.、K.L.、Y.M.、P.M.、K.L.和L.Q.参与了样本收集和数据管理。

利益声明
作者声明没有竞争利益。

**方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
**来源标识符**

**商业试剂**
TIANamp基因组DNA试剂盒（Tiangen）
Cat#DP304EZ
DNA甲基化-Lightning试剂盒（Zymo Research）
Cat#D5006
Elecsys? CEA（Roche）
Cat#07027079190
Elecsys? SCC（Roche）
Cat#07126999190
Elecsys? CYFRA 21–1（Roche）
Cat#07299966190

**存档数据**
72个PBMC DNA样本的935K微阵列数据（本文）
GEO: GSE302955
靶向亚硫酸氢盐测序数据（本文）
GEO: GSE349469和GSE349476

**软件和算法**
ESCCseeker及自定义分析代码（本文）
DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.21337420
**Stage Shift**（Hubbell等人）
GitHub: https://github.com/grailbio-publications/Hubbell_CEBP_InterceptionModelR（v. 4.4.2）
CRAN: https://www.r-project.org/pROC（v1.18.5）
Robin等人
GitHub: https://xrobin.github.io/pROC/ggplot2（v3.5.1）
Wickham等人
GitHub: https://github.com/tidyverse/ggplot2
Mfuzz（v2.66.0）（Matthias Futschik）
https://git.bioconductor.org/packages/Mfuzz
ComplexHeatmap（v2.22.0）（Gu Zhangguang）
GitHub: https://github.com/jokergoo/ComplexHeatmap
clusterProfiler（v4.0.0）（Guangchuang Yu等人）

**实验模型和研究参与者详情**
这项两阶段、多中心的前瞻性研究（ChiCTR2500095967）评估了PBMC DNA甲基化作为早期ESCC检测的工具。如图1所示，研究分为两个阶段。在模型构建阶段，2023年1月至2024年5月期间共招募了895名参与者，最终有742名被纳入分析。参与者流程图详见图S1。在发现集中，使用Infinium MethylationEPIC BeadChip（v2.0）生成了ESCC患者和对照组的甲基化谱型，以识别候选标记物。在训练集和测试集中，我们确定了一个包含12个特征（包括8个不同甲基化位置：CYFRA21-1、SCC-Ag、年龄和性别）的多维预测模型，命名为ESCCseeker。随后在验证集中评估了其性能和肿瘤特异性。值得注意的是，所有数据都是依次招募的，并相互独立。在风险分层验证阶段，我们连续招募了40至75岁的成年人，他们根据标准临床指征计划在八家医院进行内镜检查，时间范围为2024年6月至2025年2月。共招募了1,253名参与者。如果符合以下任何标准，则排除这些参与者：样本或测序质量控制失败、凝血障碍或存在警报症状。最终，有1,026名参与者被纳入分析。所有参与者均获得了书面知情同意。

**样本量**
（i）发现集。发现集的样本量使用PASS 15.0中的“Test for One ROC Curve”模块估算。基于候选标记物的预期曲线下面积（AUC）为0.80、ESCC患病率为0.6、双边α为0.05以及统计功效（1-β）为95%，计算表明至少需要25名ESCC患者和15名对照组。
（ii）训练集。训练组的样本量使用PASS 15.0中的“Tests for Two ROC Curves”模块估算。计算假设所提出模型的预期AUC≥0.90，参考方法（血清肿瘤标志物）的AUC为0.80，单边α为0.05，功效为95%，ESCC患者与对照组的招募比例为1:1。根据这些参数，至少需要147名ESCC患者和147名对照组才能达到所需的统计功效。
（iii）前瞻性队列。前瞻性队列的样本量使用PASS 15.0中的“Tests for One-Sample Sensitivity and Specificity”模块估算。基于以下参数：模型预期敏感性≥90%和特异性≥85%，单边α为0.025，功效为90%，目标高风险人群的ESCC患病率假设为1.5%。结果表明至少需要1,000名高风险个体。为了考虑潜在的20%流失率，研究设计为招募至少1,250名参与者。

**第一阶段参与者招募和临床样本分布**
为了识别ESCC患者外周血单核细胞（PBMC）中的关键DNA甲基化特征并开发和验证预测模型，我们从中国的八家医院招募了895名参与者。参与的机构包括山东大学第二医院、山东大学齐鲁医院、临沂人民医院、胜利油田中心医院、泰安市中心医院（隶属于青岛大学）、广东省人民医院、吉林大学第一医院和锦州医科大学第一附属医院。所有参与者都接受了标准化的内镜检查和活检。根据内镜和组织病理学结果，参与者被分为三组：ESCC、高级别上皮内瘤变（HGIN）或无肿瘤（对照组）。虽然验证集来自上述八家医院，但其余三个集合的样本来自山东大学齐鲁医院。排除标准包括恶性肿瘤病史、严重并发症（如口腔疾病、糖尿病、肺部疾病、肾/肝功能障碍、严重的免疫失调，或过去6个月内发生的心血管事件），或者样本/测序质量控制失败。所有血液样本均在内镜检查前采集。纳入的其他癌症患者为20岁及以上、经病理学确诊的原发性非食管癌（例如乳腺癌、肝癌、肺癌）患者。排除标准还包括多发性同时原发性肿瘤、严重并发症（如口腔疾病、糖尿病、肺部疾病、肾/肝功能障碍、严重的免疫失调，或过去6个月内发生的心血管事件）、样本采集前的任何抗肿瘤治疗，以及样本或测序质量控制失败。

### 第二阶段参与者招募
为了前瞻性地评估基于甲基化风险分层的临床效用，我们进行了一项独立的多中心队列研究，共纳入了1,253名参与者。参与者来自山东大学第二医院、山东大学齐鲁医院、临沂人民医院、胜利油田中心医院、泰山市中心医院（隶属于青岛大学）、广东省人民医院、吉林大学第一医院和锦州医学院第一附属医院。最终有1,026名参与者被纳入分析。

**纳入标准**：
- 年龄在40至75岁之间；
- 根据标准临床指征计划在八家医院进行内镜检查。

**排除标准**：
- 拒绝提供书面知情同意；
- 出现报警症状（如吞咽困难、呕血、黑便）；
- 有食管鳞状细胞癌（ESCC）或其他胃肠道恶性肿瘤病史；
- 之前接受过食管或胃部手术；
- 有凝血障碍或目前正在使用抗凝剂/抗血小板药物；
- 样本处理或测序质量控制失败。

### 前瞻性队列的研究流程
从接受内镜检查的医院人群中，符合研究纳入标准的个体被邀请参与并提供了书面知情同意。在一周内抽取外周血用于DNA甲基化（全血）和肿瘤标志物（血清：CYFRA21-1、CEA、SCC-Ag）分析。根据这些数据，参与者按照ESCC风险评分被分为低风险/高风险组，并根据TM-combine标准分为阴性/阳性组。所有参与者在90天内接受了由经验丰富的内镜医师进行的上消化道内镜检查。对于怀疑的黏膜异常，会进行详细的Lugol染色内镜检查，并对病变部位进行活检/切除以进行组织病理学评估。对于早期病变，优先考虑内镜切除；否则，会建议手术治疗。

**主要结果**是按风险组分层的高级别上皮内瘤变或ESCC的发病率。**次要结果**是按风险组分层的任何异型性改变的发病率。

### 减少评估偏倚的方法
我们采用了双盲设计来降低评估偏倚。作为参考标准的胃肠病学家和病理学家不知道参与者的最终疾病状态和正在评估的甲基化测试结果。同时，进行甲基化检测的实验室人员也不了解所有参与者的临床细节和疾病状态。

### 样本采集
在本研究中，为了最小化中心间的差异，所有参与中心严格遵循相同的操作程序，并使用相同品牌的试剂和耗材进行样本采集。所有参与中心还接受了集中培训和监督。

**外周血单核细胞（PBMCs）样本**：收集2毫升空腹血液到含有EDTA-K2的真空采血管中，并注意避免溶血。PBMCs的分离在采集后4小时内完成。简而言之，将血液样本轻轻加入Ficoll-Paque PLUS分离液表面形成一层透明液体，然后在室温下以400 g离心30分钟（Bai Yang），同时将离心机减速速度设置为0。离心后，小心吸取中间的白色浑浊层，用PBS清洗两次，获取PBMCs沉淀物。标记后将其储存在-80°C待进一步分析。

**血清样本**：使用无添加剂的真空采血管收集3毫升空腹血液，在室温下凝固30分钟，然后以5000 g离心10分钟（4°C）。血清上清液分成若干份储存在-80°C待后续使用。

### DNA提取和亚硫酸氢盐转化
使用TIANamp Genomic DNA Kit（Tiangen，中国）从PBMC样本中提取基因组DNA，并用20 μL无RNase的水进行洗脱。使用NanoDrop光谱仪（NanoDrop Technologies，美国）测量DNA浓度和纯度。A260/280比值在1.8到2.0之间的样本被认为是纯度合格的，并储存在-80°C待使用。由于DNA不足导致的失败率为1.8%。

### 基因组范围DNA甲基化分析
使用Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip微阵列（HM935K，Illumina）进行基因组范围DNA甲基化分析，该微阵列可检测超过935,000个CpG位点。亚硫酸氢盐转化后的DNA使用Infinium Methylation Assay kit进行扩增，然后与BeadChip杂交，并在iSCAN系统（Illumina，美国）上进行扫描。原始数据使用ChAMP包（v2.16.0）在R（v3.5.2）中进行预处理和标准化。排除检测p值在≥10%的样本中CpG探针、含有单核苷酸多态性的探针以及性染色体探针。过滤后，剩余923,646个CpG位点。每个CpG位点的β值通过β = M/(M + U)计算得出，其中M和U分别代表甲基化和未甲基化探针的信号强度，范围从0（未甲基化）到1（完全甲基化）。

### EWAS分析中调整PBMC细胞组成
我们应用了robust partial correlations（RPC）方法，并使用EpiDISH R包提供的cent12CT.m参考矩阵，以便分离中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、幼稚型及记忆B细胞、幼稚型及记忆CD4+和CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和T调节细胞。然后将估计的细胞类型比例作为协变量纳入全基因组关联研究（EWAS），以识别与ESCC统计相关的CpG位点。

### 校正效应大小的夸大
为了解决由于“胜者诅咒”效应（Δβ）在发现集中可能导致的效应大小夸大问题，我们应用了winnerscurse R包中的empirical_bayes函数。这种方法利用所有测试统计量的分布来生成降低偏倚的效应估计值。对于成功设计的48个候选DMPs，我们也应用了相同的收缩程序来获得收缩调整后的效应估计值。

### 靶向亚硫酸氢盐测序
使用MethylTarget（上海GeneCowin Biotechnology Co., Ltd.，中国）进行候选CpG位点的靶向甲基化分析，这是一个基于NGS的多重靶向CpG甲基化平台。在亚硫酸氢盐转化的DNA序列上设计PCR引物。使用优化的引物组合进行多重PCR扩增，生成170–270 bp的产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离并用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，美国）纯化。文库被定量、合并后，在Illumina HiSeq 4000平台（Illumina，美国）上进行测序（2 × 150 bp双端）。甲基化水平计算为每个CpG位点上甲基化胞嘧啶的比例。由于测序质量控制失败导致的失败率为0.9%。

### 血清ESCC标志物检测和TM-combine规则
血清样本被送到中央实验室储存，然后由同一组受过培训的人员使用Roche cobas 8000系统进行检测。蛋白质标志物的检测阈值统一定义为CYFRA21-1 >3.3 U/mL、SCC-Ag >2.7 ng/mL和CEA >5.0 ng/mL。如果任何一个标志物超过其相应阈值，则将个体分类为TM-combine(+)；如果三个标志物都为阴性，则分类为TM-combine(?)。

### 基于机器学习的ESCCseeker开发和验证
首先选择q值排名前50的CpG位点作为候选特征。在100名ESCC患者和101名对照组的PBMC样本中进行靶向验证，确认了48个差异甲基化位点（DMPs）（标准：q值<0.05且TBS数据和阵列数据趋势一致）。通过调整年龄和性别的单变量和多变量逻辑回归分析，独立识别出38个与ESCC相关的差异甲基化位点（DMPs）。随后使用L1正则化的LASSO回归得到了9个具有非零系数的稳健甲基化标志物。为了验证生物标志物的可行性，我们将训练集扩展到预估计的大小（152名ESCC患者和151名对照组）。基于这9个验证的DMPs，我们使用XGBoost构建了一个甲基化模型（9-Methy）。为了进一步提高性能，结合了这9个DMPs、人口统计学数据和蛋白质标志物，应用LASSO回归选择具有非零系数的特征来构建多维模型，最终保留了9个DMPs以及年龄、性别、SCC-Ag和CYFRA21-1。

### ESCCseeker的开发和验证
使用了四种算法——Logistic Regression、eXtreme Gradient Boosting、Support Vector Machine和Light Gradient Boosting Machine——并使用12个关键特征进行5折交叉验证。通过Delong测试（p值<0.05）选择最优算法。随后使用Youden指数确定选定模型的临界值。最终参数在训练集中锁定，并应用于测试和验证集以生成预测分数并评估ESCCseeker的性能。

### 构建仅基于甲基化的多维模型
使用k-nearest neighbor（impute v1.80.0）方法进行插补，参数设置k = 10。排除甲基化百分比超过50%的样本。数据使用R中的scale包进行标准化。使用5折交叉验证训练了四种机器学习模型：Logistic Regression（caret v7.0-1、glmnet v4.1-8、bestglm v0.37.3）、XGBoost（caret v7.0-1、xgboost v1.7.8.1）、SVM（caret v7.0-1、e1071 v1.7-16和lightgbm v4.5.0）。基于AUC选择最优多维模型，并命名为ESCCseeker。甲基化模型使用XGBoost算法和5折交叉验证构建，命名为9-Methy。

### ESCCseeker和TM-combine的风险分层
为了评估ESCCseeker和TM-combine面板在ESCC风险分层中的临床适用性，建立了以下定义。使用第一阶段训练集中Youden指数确定的0.5临界值（敏感性=0.95，特异性=0.95），将参与者分为低风险（≤0.5）和高风险（>0.5）组，而TM-combine面板将他们分类为TM-combine(?)或TM-combine(+)。

### 阶段转换分析
我们进行了阶段转换分析，以评估在内镜筛查中实施ESCCseeker的临床益处。基于Hubbell等人开发的模型，我们将依从性比例从0%变化到100%（以10%为增量）作为模拟参数，模拟筛查依从性变化、5年死亡率降低和生存结果。分析代码见关键资源表。无筛查基线的输入数据来自SEER数据库。

### ESCCseeker可视化平台
ESCCseeker可视化平台使用R中的Shiny包（v1.10.）开发，提供交互式界面进行ESCC风险评估。用户可以通过侧边栏面板输入所有相关特征的测量值，平台计算个体的ESCCseeker风险评分。它自动分类风险等级（例如低风险或高风险），并提供相应的临床建议。该应用程序公开可用，并部署在shinyapps.io服务器上：https://esccwarning.shinyapps.io/ESCCseeker/。

### 定量和统计分析
所有分析均在R（v4.2.2）中进行。使用频率和百分比总结人口统计学和基线特征（分类变量），以及均值、标准差（SD）和中位数（连续变量）。组间比较使用Wilcoxon秩和检验（非参数）或Student’s t检验（参数化）。三个或更多组之间的比较使用one-way ANOVA（参数化）或Kruskal-Wallis检验（非参数）。在适用的情况下，使用Benjamini-Hochberg程序计算q值（假发现率，FDR）。统计显著性如下表示：?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001；ns表示无显著性。所有实验的统计细节可以在相应的图例中找到。

DNA甲基化标志物、血清肿瘤标志物和ESCCseeker的预测性能通过接收者操作特征（ROC）分析（pROC v1.18.5）进行评估和比较，ROC曲线之间的统计差异通过DeLong检验进行评估。所包括的指标有AUC、灵敏度、特异性、准确性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV），每个指标的95%置信区间（CIs）均采用Agresti–Coull方法估算。这些诊断准确性指标的统计比较使用了McNemar检验进行。数据可视化使用了ggplot2（v3.5.1）进行散点图、棒状图和箱线图的绘制，mfuzz（v2.66.0）进行时间序列聚类，以及ComplexHeatmap（v2.22.0）生成热图。
补充信息（4）
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文档S1：图S1–S7和表S1–S6
电子表格（16.50 KB）：表S7，包含TBS检测中48个候选DMP的引物序列，与图3相关
PDF（295.73 KB）：数据S1，本研究临床研究方案
PDF（9.26 MB）：文档S2，文章及补充信息