利用Cas9-ACROBAT蛋白酶体调控抗CRISPR分子，从而控制CRISPR-Cas9的活性

《Cell Reports Methods》：Proteasomal control of anti-CRISPRs for the regulation of CRISPR-Cas9 activity using Cas9-ACROBAT

**动机**
在基因组编辑过程中，精确控制CRISPR-Cas9的活性对于减少脱靶切割和限制细胞毒性至关重要。现有的可诱导平台主要依赖于转录调控，但存在动力学延迟和基础泄漏的问题，导致对CRISPR活性的时间控制较差。为了解决这些限制，我们基于天然的金黄色葡萄球菌Cas9抑制剂蛋白AcrIIA4，设计了一种翻译后和转录后的门控机制。通过将小分子调控的degron标记的AcrIIA4与茶碱响应的riboswitch sgRNA耦合，我们建立了Cas9-ACROBAT平台，实现了在各种人类细胞模型中对CRISPR切割、激活和干扰的快速、可逆且严格的调控。

**亮点**
- Degron融合的抗CRISPR AcrIIA4能够通过小分子来控制Cas9的活性
- 茶碱响应的riboswitch sgRNA阻止了Cas9与引导序列的组装
- 双重门控的riboswitch/degron控制的Cas9-ACROBAT消除了泄漏现象
- Cas9-ACROBAT平台实现了对CRISPR的快速和可逆调控

**摘要**
精确调控CRISPR-Cas9的活性对于限制脱靶效应和提高基因组工程的安全性至关重要。为了实现对Cas9的可逆和稳健控制，我们开发了多种响应小分子的系统来调节抗CRISPR蛋白AcrIIA4的稳定性。通过将AcrIIA4与dTAG、SMASh或ecDHFR degrons融合，我们实现了依赖配体的抑制剂降解或稳定，从而在人类细胞中严格调控CRISPR的切割、激活和干扰。为了进一步消除背景Cas9活性，我们在sgRNA支架中引入了茶碱响应的riboswitch，在添加配体之前阻止Cas9与sgRNA的组装。结合riboswitch sgRNA和degron控制的AcrIIA4，形成了Cas9-ACROBAT平台，该平台几乎完全抑制了CRISPR的泄漏，同时保持了强大的基因组编辑和转录调控能力，包括对PLK1、CDKN1A和CCND1等内源性靶标的调控。Cas9-ACROBAT提供了一种多功能、模块化的策略，用于精确的小分子控制CRISPR系统。

**引言**
CRISPR-Cas9技术的便捷性彻底改变了研究人员操纵基因组进行生物学研究的方式。由于Cas9是一种在基因组DNA中产生双链断裂的核酸酶，因此对其活性进行精确控制以减少脱靶效应至关重要。为了更好地控制Cas9活性，研究人员开发了更高保真的Cas9突变体、多西环素和蓝光可诱导的Cas9变体以及其他可诱导的Cas9系统。一类名为抗CRISPRs（Acrs）的蛋白质的发现为限制和控制Cas9功能提供了另一种方法。这些Acrs是天然存在于噬菌体中的小蛋白质，它们与Cas9-sgRNA复合物结合，从而阻止其与DNA的结合，使噬菌体具有对抗基于CRISPR的细菌免疫的机制。我们试图工程化一种天然存在的Acr CRISPR抑制剂AcrIIA4，并为其添加一个蛋白质标签，以便通过添加小分子来控制Acr蛋白的稳定性。降解标签（dTAG）将FKBP12F36V结构域与目标蛋白质融合，然后可以通过一种名为dTAG-13的蛋白酶-targeting嵌合体（PROTAC）小分子来控制其稳定性。dTAG-13小分子本身有两个功能部分：一部分与FKBP12F36V结构域结合，另一部分与cereblon E3连接酶复合体相互作用，有效地将蛋白质降解机制招募到目标蛋白质上，通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）将其降解。

虽然dTAG系统通过E3连接酶的招募提供了一种有效的小分子诱导目标降解机制，但其他化学遗传策略也具有独特优势，包括小分子的大小和潜在的临床可行性。其中之一是小分子辅助关闭（SMASh）标签系统，该系统源自丙型肝炎病毒（HCV）NS3蛋白酶及其顺式切割底物序列。在基础条件下，融合的SMASh结构域会从目标蛋白质上自我切割；当加入临床批准的抗病毒药物asunaprevir时，NS3蛋白酶活性被阻断，防止分离并使整个SMASh融合蛋白快速通过蛋白酶体降解。

大肠杆菌二氢叶酸还原酶（ecDHFR）的不稳定性结构域（DD）采用了一种相反的逻辑：将工程化的ecDHFR变体与目标蛋白质融合，使整个融合蛋白质持续不稳定，从而驱动持续的泛素介导的蛋白酶体降解。FDA批准的抗生素trimethoprim（TMP）与ecDHFR结构域结合，可以稳定其结构，防止其被蛋白酶体降解，允许ecDHFR标记的融合蛋白质在细胞内快速积累。

在这项研究中，我们生成了AcrIIA4的dTAG、SMASh和ecDHFR融合体，当表达时，这些融合体会持续抑制金黄色葡萄球菌的Cas9（spCas9）-sgRNA复合物。使用dTAG-13化合物或asunaprevir处理会通过UPS破坏AcrIIA4，从而释放CRISPR-Cas9的活性；相反，去除TMP会导致ecDHFR融合体不稳定，从而激活CRISPR-Cas9活性。此外，我们还设计了含有茶碱可切割riboswitch的sgRNA作为另一层调控手段。加入茶碱后，riboswitch被激活并自我切割，释放sgRNA以与Cas9结合。将条件性degron标记的AcrIIA4与riboswitch sgRNA结合，可以在人类细胞中对CRISPR-Cas9活性进行严格调控。

**结果**
**使用degron控制的Acr蛋白AcrIIA4调控CRISPR-Cas9切割**
为了测试我们的degron控制的AcrIIA4系统（图1A），我们生成了一系列由慢病毒CMV驱动的双基因载体，这些载体表达AcrIIA4-dTAG融合体以及不同的spCas9衍生物，分别用于DNA切割（CRISPRa）或抑制（CRISPRi），并通过T2A肽分隔（图S1A）。我们进行了dTAG-13剂量响应实验，以检查在稳定表达图S1A中所示DNA切割载体的细胞（HCECs）中AcrIIA4的表达情况。dTAG-13处理后72小时，AcrIIA4的表达量下降，在200 nM的剂量下达到最大效果（图1B），除非另有说明，所有后续研究均使用此剂量。我们使用针对重复端粒序列的sgRNA检测切割动力学，并通过H2A.X磷酸化来评估DNA损伤。dTAG-13处理后1小时内就观察到了磷酸化H2A.X的增加（图S1B）。接下来，我们用表达AcrIIA4-dTAG成分和Cas9的GFP+ HCECs，并用Adeno-associated病毒整合位点1（AAVS1）对照sgRNA或针对GFP的sgRNA序列进行转染。DMSO对照处理或dTAG-13处理对表达对照sgRNA的细胞中的GFP表达没有影响（图1C），而在表达针对GFP的sgRNA的细胞中观察到dTAG-13剂量依赖性的GFP表达下降（图1C）。

**通过dTAG控制的AcrIIA4调节CRISPR基因切割**
- **AcrIIA4-dTAG系统**：dTAG融合的抗CRISPR蛋白AcrIIA4与Cas9-sgRNA复合物结合，阻止DNA结合。dTAG-13处理导致AcrIIA4通过蛋白酶体降解，使Cas9-sgRNA复合物能够与DNA结合，从而释放CRISPR活性。
- **通过dTAG-13剂量响应调节AcrIIA4表达**：稳定表达AcrIIA4-dTAG的HCECs以指定浓度处理dTAG-13三天。从这些细胞中提取样本进行免疫印迹，检测AcrIIA4的丢失情况。
- **dTAG控制CRISPR切割**：稳定表达Cas9和AcrIIA4-dTAG的HCECs用针对GFP的sgRNA或AAVS1对照sgRNA进行转染。细胞用DMSO或指定浓度的dTAG-13处理七天，然后通过流式细胞术检测GFP荧光。
- **dTAG控制内源性基因切割**：稳定表达Cas9和AcrIIA4-dTAG的HCECs用针对PLK1的sgRNA或AAVS1对照sgRNA进行转染。处理五天后提取样本进行免疫印迹。

**通过degron标签的AcrIIA4调节CRISPRa和CRISPRi基因表达**
除了基因切割和失活外，CRISPR调控的基因激活（CRISPRa）也是细胞生物学和遗传筛选的强大工具。我们使用与VP64、p65/RelA和rTA（VPR）转激活结构域融合的nuclease-dead dCas9共同表达的AcrIIA4-dTAG系统来调控dTomato荧光报告基因的表达。稳定表达AcrIIA4-dTAG和dCas9-VPR构建体以及dTomato报告基因的人胰腺nestin阳性上皮细胞（HPNEs）被AAVS1对照或报告基因靶向sgRNA转染。dTAG-13处理后，dTomato报告基因的表达量呈剂量依赖性增加，这与AcrIIA4表达的减少相关（图2A）。我们通过流式细胞术测量dTomato报告基因的表达，发现dTomato表达在大约40%的细胞中发生激活（图2B）。这可能是由于我们使用了三种不同构建体转染的多克隆细胞群体。尽管细胞经过药物筛选以确保构建体的整合，但并非所有细胞都会含有等效和最佳的每个成分表达。

**图2 通过dTAG控制的AcrIIA4调节基因激活**
- **AcrIIA4-dTAG控制的报告基因激活**：稳定表达dCas9-VPR和AcrIIA4-dTAG的HPNEs用针对启动子的sgRNA（sgReporter）或AAVS1对照sgRNA进行转染。dTAG-13处理后五天，通过流式细胞术分析dTomato+细胞的比例。
- **通过AcrIIA4-dTAG控制的CRISPra调节内源性基因激活**：稳定表达Cas9和AcrIIA4-dTAG的HCECs用针对CDKN1A/p21的sgRNA或AAVS1对照sgRNA进行转染。处理后五天，通过细胞计数测量细胞增殖情况。正如预期的那样，p21表达的增加导致了细胞增殖的减少（图2D）。我们使用CRISPR干扰（CRISPRi）技术在稳定表达AcrIIA4-dTAG构建体的GFP+ HCEC细胞中测试了控制基因表达的能力，该构建体包含与转录抑制性Krüppel相关盒（KRAB）结构域融合的核酸酶失活的dCas9（图2E）。细胞被AAVS1对照或GFP sgRNA转染。用dTAG-13处理以降解AcrIIA4，从而激活CRISPRi活性，仅喺表达GFP靶向sgRNA的细胞中观察到GFP报告基因表达的减少，这一点通过Western blotting（图2F）和流式细胞术（图2G）得到证实。

我们使用SMASh标签作为控制AcrIIA4活性的另一种方法。在这种方法中，NS3病毒蛋白酶结构域被融合到AcrIIA4的氨基末端，其前直接是NS3蛋白酶的底物基序。在基础条件下，NS3蛋白酶会从AcrIIA4上切割自身，从而允许CRISPR抑制。使用NS3蛋白酶抑制剂asunaprevir处理可以防止AcrIIA4上的切割，导致其通过蛋白酶体降解并诱导CRISPR活性（图3A）。我们生成了一组类似的慢病毒SMASh标签AcrIIA4构建体来控制CRISPR活性（图S1C）。利用稳定表达SMASh-AcrIIA4 CRISPR切割构建体的HCECs，我们观察到72小时后AcrIIA4的剂量依赖性丢失，并且除非另有说明，所有后续实验都使用1 μM的asunaprevir（图3B）。我们使用稳定表达SMASh-AcrIIA4和Cas9的GFP+ HCECs，并将它们转染为靶向AAVS1对照或GFP转基因的慢病毒sgRNAs。经过1 μM asunaprevir处理后，我们观察到AcrIIA4表达减少，这与GFP表达减少相关（图3C）。我们使用了之前在图2A中描述的表达dTomato报告基因的HPNE细胞，并稳定表达了共表达dCas9-VPR的SMASh-AcrIIA4构建体，以检查CRISPRa的调控效果。表达靶向报告基因而非AAVS1对照的sgRNA的细胞显示出dTomato报告基因表达的剂量依赖性增加（图3D和3E）。时间进程实验显示，在连续5天asunaprevir处理后dTomato报告基因表达达到峰值（图3F和3G）。

图3 SMASh标签AcrIIA4的特性描述
- （此处可添加完整的图例说明）

**图查看器：**
- (A) SMASh-AcrIIA4系统的示意图。SMASh标签的AcrIIA4与Cas9-sgRNA复合物结合，在SMASh标签的NS3蛋白酶结构域切割DNA后阻止其结合。asunaprevir处理阻断NS3蛋白酶活性，导致AcrIIA4通过蛋白酶体降解，从而使Cas9-sgRNA复合物能够与DNA结合。
- (B) 通过asunaprevir剂量响应观察到AcrIIA4表达的丢失。稳定表达SMASh-AcrIIA4的HCECs用不同浓度的asunaprevir处理3天。从这些细胞中提取样品进行Western blotting，以监测AcrIIA4的丢失情况。
- (C) SMASh-AcrIIA4对CRISPR切割的调控作用。稳定表达Cas9、SMASh-AcrIIA4和GFP的HCECs被转染为靶向GFP或AAVS1对照的sgRNAs。细胞用DMSO或1 μM asunaprevir处理7天。细胞裂解液用相应抗体进行Western blotting，以监测AcrIIA4和GFP的丢失情况。条形图表示Western blot中GFP/vinculin的比率。
- (D) 通过Western blot显示SMASh-AcrIIA4和asunaprevir对dTomato CRISPRa报告基因的剂量依赖性响应。稳定表达dCas9-VPR、SMASh-AcrIIA4和由最小CMV启动子控制的dTomato转基因的HCECs被转染为靶向启动子的sgRNAs（sgReporter）。细胞用DMSO或不同浓度的asunaprevir处理5天。从这些细胞中提取样品进行Western blotting，以监测FLAG-dTomato的表达情况。
- (E) 通过流式细胞术分析处理后dTomato CRISPRa报告基因的SMASh-AcrIIA4和asunaprevir剂量依赖性响应。来自(D)的细胞用DMSO或不同浓度的asunaprevir处理5天，并通过流式细胞术确定dTomato+细胞的百分比。*表示p值<0.05，通过学生t检验比较每个asunaprevir剂量下的dTomato+百分比与sgAAVS1对照加溶剂条件下的百分比，误差条表示SEM。
- (F) asunaprevir处理后的dTomato诱导时间进程。图2D中描述的细胞用1 μM asunaprevir处理，并在指定时间点收集样本。细胞裂解液用相应抗体进行Western blotting，以监测dTomato报告基因的诱导情况。
- (G) asunaprevir处理后的dTomato荧光时间进程。图(F)中的细胞通过流式细胞术分析dTomato+细胞的百分比。*表示p值<0.05，通过学生t检验比较每天dTomato+百分比与0天时sgAAVS1对照加溶剂条件下的百分比，误差条表示SEM。

**另见图S1**

**通过利用大肠杆菌ecDHFR不稳定化结构域调控CRISPR活性的方法：**
我们最初的CRISPRi实验使用dTAG-AcrIIA4融合体实现了对GFP表达的强抑制，但没有完全丢失（图2F）。为了改进CRISPRi的控制，我们开发了一种方法，将ecDHFR DD融合到AcrIIA4上。用TMP处理表达ecDHFR-AcrIIA4的细胞会通过稳定ecDHFR DD来增加ecDHFR-AcrIIA4蛋白的量，从而导致CRISPR活性降低（图4A）。我们将dCas9-KRAB和ecDHF-AcrIIA4融合蛋白通过将CAG启动子驱动的表达盒敲入HEK293T细胞的AAVS1位点来引入（图4B）。该靶向构建体还包括pyromycin抗性和mCherry表达盒，两侧有loxP位点，这样一旦选择了敲入细胞，我们可以通过表达Cre重组酶来删除选择盒，从而创建一个没有可选标记的细胞系（图4B）。感兴趣的sgRNA可以通过慢病毒引入，并用hygromycin进行选择。我们还包括一个由SV40启动子驱动的慢病毒CRISPRi报告基因，其中包含sgRNA位点（图4B）。

**使用ecDHFR-AcrIIA4控制的可诱导CRISPRi系统调控基因表达：**
- (A) ecDHFR-AcrIIA4 CRISPRi系统的示意图。ecDHFR-AcrIIA4蛋白水平通过TMP的存在来控制。TMP结合并稳定ecDHFR的不稳定化结构域，导致ecDHFR-AcrIIA4蛋白增加，从而通过Cas9抑制降低CRISPRi活性。
- (B) 用于GFP CRISPRi报告基因和sgRNA表达的慢病毒质粒，以及针对AAVS1的集成CRISPRi系统。慢病毒GFP CRISPRi报告基因由SV40启动子驱动GFP表达，SV40启动子包含用于CRISPRi靶向的sgRNA位点（黄色线），可以通过GFP荧光分析。另一个慢病毒载体用于递送U6驱动的sgRNA和hygromycin选择标记。可诱导的CRISPRi成分被克隆到靶向AAVS1位点的质粒中，以表达dCas9-KRAB CRISPRi蛋白、ecDHFR-AcrIIA4以及由floxed EF1启动子驱动的pyromycin抗性基因和mCherry，用于选择敲入细胞。用Cre重组酶处理将删除选择盒。
- (C) HEK293T细胞表达来自(B)的AAVS1 CRISPRi敲入系统，并用靶向SV40启动子的sgRNA处理，然后用指定浓度的TMP处理。8天后通过流式细胞术确定GFP+细胞的百分比。
- (D) 在不同TMP剂量下比较GFP表达。表达(C)中慢病毒系统的细胞以及对照或SV40启动子靶向sgRNAs的细胞用指定浓度的TMP处理。通过流式细胞术确定GFP表达。
- (E) 使用ecDHFR-AcrIIA4控制的CRISPRi调节CD146表达。AAVS1诱导的CRISPRi敲入HEK293T细胞表达两种不同的CD146 sgRNAs，并用逐渐增加的TMP剂量处理。用Alexa Fluor 647抗-CD146抗体染色细胞后，通过流式细胞术确定CD146表达，并在处理8天后量化CD146+细胞的百分比。
- (F) TMP剂量响应显示高度可控的CD146表达水平。来自(E)的HEK293T细胞表达对照或CD146 sgRNAs，并用不同剂量的TMP处理，8天后通过流式细胞术分析CD146表达。

我们在HEK293T AAVS1诱导的CRISPRi敲入细胞中表达了我们的GFP CRISPRi报告基因和靶向SV40启动子的sgRNA。我们比较了不同TMP剂量处理6天后的GFP表达水平。正如预期的那样，增加TMP的剂量会导致CRISPr活性降低，表现为GFP表达的剂量依赖性增加（图4C）。重要的是，用对照sgRNA处理的GFP+ HEK293T细胞与用10 μM TMP处理的GFP sgRNA细胞具有相似的GFP表达水平，表明CRISPr活性受到强抑制（图4D）。接下来，我们使用我们的HEK293T AAVS1敲入CRISPRi系统来控制内源基因CD146/melanoma细胞黏附分子（MCAM）的表达。我们将两种不同的sgRNAs转染到我们的HEK293T细胞中（图S1D），并比较了不同TMP剂量下的CRISPr控制效果（图4E）。如我们的GFP报告基因细胞所见，逐渐增加的TMP浓度导致CRISPr活性受损，同时CD146表达增加（图4E）。用10 μM TMP处理表达CD146 sgRNAs的细胞表现出与对照sgRNA相似的表达，而用0 μM TMP处理则几乎完全失去了CD146表达（图4F）。

为了评估ecDHFR CRISPr的可逆性，我们使用GFP报告基因和CD146靶向sgRNAs系统进行了时间进程实验。我们在HEK293T和A-375黑色素瘤细胞系中稳定表达了AcrIIA4-ecDHFR、dCas9-KRAB融合蛋白和靶向AAVS1对照位点、GFP报告基因或CD146基因的sgRNAs。在HEK293T细胞中，停止TMP处理后，CD146和GFP表达在第6天完全消失（图S2A和S2B）。第6天后，我们加入10 μM TMP以稳定AcrIIA4-ecDHFR蛋白，从而抑制CRISPr活性。在接下来的6天连续TMP处理期间，我们观察到CD146和GFP表达的增加（图S2A和S2B），证明了使用ecDHFR-AcrIIA4系统的基因抑制可逆性。在A-375黑色素瘤细胞中也获得了类似的结果（图S2C和S2D），证明了TMP诱导的基因抑制在细胞系间的可逆性。

这些结果共同表明，ecDHFR-AcrIIA4 CRISPr系统可以强有力地控制内源基因表达，提供了另一种与SMASh和dTAG系统并列的正交方法。

**结合核糖开关调控的sgRNAs和降解子控制的AcrIIA4以实现更精确的CRISPr切割活性控制：**
我们最初使用AcrIIA4-dTAG的实验在控制CRISPr切割活性方面存在一些泄漏性，即使在没有dTAG-13的情况下也观察到GFP荧光的丢失（图1C）。为了更严格地控制CRISPr功能，我们重新设计了sgRNAs，加入了小分子控制的核糖开关。我们在引导RNA支架的3′端插入了一个HDV核糖酶和一个嵌入了茶碱核糖开关的结构，该结构与tracrRNA茎环1和部分茎环2的区域互补。在没有茶碱的情况下，核糖开关保持在“关闭”位置，茎环阻断序列阻止引导RNA与Cas9结合。加入茶碱后，开关被激活并自我切割，释放核糖酶/核糖开关和阻断序列，使引导RNA能够与Cas9有效结合。重要的是，这种格式使得sgRNAs的控制独立于引导序列。我们将这种降解子控制的Acr与核糖开关调控的sgRNAs的组合称为“Cas9-ACROBAT系统”（图5A）。

**图5 结合核糖开关调控的sgRNAs和降解子标记的AcrIIA4以控制CRISPr基因切割活性：**
- (A) Cas9-ACROBAT系统。在sgRNA的3′端添加了茶碱核糖开关。核糖开关结构域的3′端有一个与sgRNA支架互补的碱基区域，通过防止Cas9结合将其保持在非活性构象。茶碱处理激活核糖开关，并将核糖开关从sgRNA上切割下来，使sgRNA能够与Cas9结合。将核糖开关sgRNAs与AcrIIA4-dTAG结合，提供了对CRIsPr活性的增强控制。
- (B)核糖开关/dTAG对CRIsPr切割的控制。稳定表达Cas9、AcrIIA4-dTAG和GFP的HCECs被转染为靶向GFP或AAVS1对照序列的普通或核糖开关融合的sgRNAs。细胞用逐渐增加的茶碱（0、0.1、0.5和1 μM）和DMSO或200 nM dTAG-13处理。这些细胞在指定处理5天后，提取物经过免疫印迹鉴定目标蛋白质。(C) 在dTAG-13/核糖开关诱导Cas9活性后，GFP荧光减弱。处理7天后，通过流式细胞术测定GFP+细胞的百分比。?表示p值<0.05，通过Student’s t检验将每种处理的GFP+百分比与不含茶碱和dTAG-13的sgAAVS1对照组（黑色条）进行比较。误差条代表标准误差（SEM）。(D) 通过核糖开关和SMASh-AcrIIA4抑制CRISPR活性。稳定表达Cas9和SMASh-AcrIIA4及GFP的HCECs被转染了针对GFP的19个核苷酸长的阻断核糖开关融合sgRNAs或针对AAVS1的对照序列。细胞在含有递增量茶碱（0、0.1、0.5和1 μM）和DMSO或1 μM asunaprevir的条件下处理7天。细胞裂解物用指定抗体进行免疫印迹，以监测AcrIIA4和GFP的消失情况。(E) 使用SMASh-AcrIIA4和核糖开关sgRNAs控制CRISPR基因切割。稳定表达Cas9和SMASh-AcrIIA4及GFP的HCECs被转染了正常的或19个核苷酸长的阻断核糖开关融合sgRNAs或针对AAVS1的对照序列。细胞按照(D)中的方法处理，处理7天后通过流式细胞术测定GFP+细胞的百分比。?表示p值<0.05，通过Student’s t检验将每种处理的GFP+百分比与不含茶碱和asunaprevir的sgAAVS1对照组（黑色条）进行比较。误差条代表标准误差（SEM）。(F和G) 核糖开关和dTAG-13控制内源基因切割。稳定表达Cas9和AcrIIA4-dTAG的HCECs被转染了针对AAVS1对照（F）或PLK1（G）的核糖开关融合sgRNAs。细胞按照指示方法处理（200 nM dTAG和1 μM茶碱），并通过细胞计数测定增殖情况。?表示p值<0.05，通过Student’s t检验将每个条件第4天的细胞数量与含有溶剂的sgAAVS1对照组进行比较。误差条代表标准误差。另见图S3和S4。

为了测试Cas9-ACROBAT系统，我们使用表达GFP和Cas9-ACROBAT的HCECs进行切割，并用传统的针对GFP的sgRNAs或针对AAVS1对照的sgRNAs进行转染。使用dTAG-13处理会导致AcrIIA4表达的丢失，这与使用的sgRNA无关（图5B）。重要的是，使用200 nM dTAG-13和1 μM茶碱处理GFP核糖开关sgRNA的细胞表现出与使用传统sgRNAs相同的GFP荧光减弱，表明在使用核糖开关sgRNAs时不存在效力损失（比较图5B中的第4和12条）。如前所述，即使在没有dTAG-13的情况下，传统的针对GFP的sgRNA也会导致一些Cas9活性泄漏，约有10%的细胞失去了GFP（图5C）。包含核糖开关调节的sgRNAs的Cas9-ACROBAT系统消除了这种泄漏（图5C）。dTAG-13与递增量的茶碱联合处理导致GFP荧光通过流式细胞术测得的减弱程度增加（图5C）。

我们还设计了不与sgRNA支架互补的核糖开关调节的sgRNAs，并观察到在添加茶碱后GFP表达的损失非常小，这表明sgRNA支架和核糖开关之间的碱基配对对于正确抑制CRISPR活性是必要的（图S3A）。将图5中使用的19个核苷酸的茎环碱基配对区域缩短到16个核苷酸也减弱了核糖开关sgRNAs在控制CRISPR活性方面的效果（图S3B）。在所有后续实验中，我们使用了19个核苷酸长的互补核糖开关。总体而言，我们发现带有SMASh标签的AcrIIA4对Cas9活性的控制比AcrIIA4-dTAG更不稳定。为了尝试减轻这种不稳定性，我们将SMASh-AcrIIA4与Cas9-ACROBAT系统中的核糖开关控制的sgRNAs结合，并检查了GFP表达的调节情况。用茶碱和asunaprevir处理导致GFP表达的剂量依赖性下降，这与AcrIIA4的丢失相关（图5D）。接下来，我们将传统sgRNAs与图5C中的核糖开关sgRNAs进行了比较。在没有asunaprevir处理的情况下，传统的针对GFP的sgRNAs显示出Cas9切割活性泄漏，而使用与SMASh-AcrIIA4配对的核糖开关sgRNAs可以消除这种泄漏（图5E）。我们发现碱基配对的互补性和长度对于带有SMASh标签的Cas9-ACROBAT都是关键的，这与我们使用dTAG版本时观察到的结果相似（图S4A和S4B）。

我们通过靶向PLK1来测试Cas9-ACROBAT对内源基因切割的效果，如图1C所示。我们监测了表达AcrIIA4-dTAG和Cas9的HCECs在使用针对控制AAVS1或PLK1的核糖开关调节的sgRNAs进行基因切割时的细胞增殖情况。无论是单独使用dTAG-13还是dTAG-13加上茶碱处理，都没有影响表达AAVS1核糖开关sgRNAs的细胞的生长（图5F）。相反，在使用dTAG-13处理后，表达PLK1核糖开关sgRNAs的细胞增殖减少了，而茶碱处理进一步增强了这种减少（图5G）。值得注意的是，未经处理的PLK1核糖开关sgRNA细胞的生长率与对照组细胞无法区分，表明使用完整的Cas9-ACROBAT系统结合核糖开关sgRNAs能够强烈抑制CRISPR活性。

最后，我们使用Cas9-ACROBAT系统来控制CRISPR基因的激活。我们使用了表达dCas9-VPR和AcrIIA4-dTAG的HCECs，以及由包含4个sgRNA靶点位点的最小启动子驱动的GFP报告基因（图6A）。使用传统的针对对照序列的sgRNAs不会影响GFP的表达，但使用针对GFP报告基因的传统sgRNAs在dTAG-13处理后能够导致GFP的显著表达（图6A和6B）。值得注意的是，即使在没有dTAG-13的情况下，使用传统的GFP报告基因系统也会观察到GFP的增加（比较图6A中的第1和3条）。当使用核糖开关sgRNAs时，这种泄漏完全消失（比较图6A中的第3和5条）。

图6 核糖开关调节的sgRNAs和degron标签的AcrIIA4控制CRISPR基因激活
显示完整标题
图查看器
(A) 核糖开关和dTAG-13控制报告基因的激活。稳定表达dCas9-VPR和AcrIIA4-dTAG以及由最小合成（SCP2）启动子控制的GFP转基因的HCECs被转染了针对启动子（Reporter）或针对AAVS1对照（Ctl）的普通或核糖开关融合的sgRNAs。细胞在含有递增量茶碱（0、0.1、0.5和1 μM）和DMSO的条件下处理，有时还加入200 nM dTAG-13。这些细胞在指定处理5天后，提取物经过免疫印迹鉴定目标蛋白质。
(B) 通过流式细胞术检查(A)中的细胞中GFP+细胞的百分比。?表示p值<0.05，通过Student’s t检验将每种处理的GFP+百分比与不含茶碱和dTAG-13的sgAAVS1对照组（最左侧的黑色条）进行比较。误差条代表标准误差（SEM）。
(C) 核糖开关和dTAG-13控制内源基因的激活。稳定表达dCas9-VPR和AcrIIA4-dTAG的HCECs被转染了针对AAVS1或CCND1/cyclin D1的核糖开关sgRNAs。细胞在含有茶碱（0、0.5和1 μM）和DMSO的条件下处理，有时也加入200 nM dTAG-13。这些细胞在指定处理5天后，提取物经过免疫印迹鉴定目标蛋白质。
(D) 核糖开关调节CRISPR控制CCND1/cyclin D1的增殖。如(C)所述并处理的细胞在指定的时间过程中被接种并计数以监测增殖情况。?表示p值<0.05，通过Student’s t检验将每种条件第6天的细胞数量与含有溶剂的sgAAVS1对照组进行比较。误差条代表标准误差。另见图S4和S5。

我们使用Cas9-ACROBAT系统激活了编码cyclin D1蛋白的内源基因表达，cyclin D1是S期进入和细胞增殖的强效驱动因子。使用针对CCND1而非AAVS1对照的核糖开关控制的sgRNAs处理后，dTAG-13和茶碱处理增加了cyclin D1的表达（图6C）。我们测量了这些细胞的增殖，并发现当使用Cas9-ACROBAT激活cyclin D1表达时，茶碱剂量和dTAG-13的添加导致生长增加（图6D）。

带有dCas9-VPR的SMASh标签的AcrIIA4与图6A中的GFP报告基因系统结合使用传统sgRNAs时显示出显著的不稳定性（图S4C）。使用Cas9-ACROBAT后，这种不稳定性完全消除（图S4C）。最后，我们通过使用dTAG-13和茶碱的洗脱来确定ACROBAT系统的可逆性。我们使用了同时表达ACROBAT调节的CRISPRa和图6A中描述的GFP报告基因系统的HCECs，并稳定表达了针对AAVS1或GFP报告基因的核糖开关sgRNAs。我们将细胞在200 nM dTAG和1 μM茶碱的条件下处理48小时，观察到只有表达报告基因sgRNAs的细胞中GFP表达增加，这与AcrIIA4表达的丢失相关（图S5A和S5B）。接下来，我们洗除了dTAG-13和茶碱，以检查一旦ACROBAT再次抑制CRISPRa活性后GFP表达的随时间损失情况。洗脱6天后，GFP表达恢复到未诱导的水平，证明使用ACROBAT可以在一周内完全可逆地控制CRISPRa（图S5B和S5C）。

讨论
精确控制CRISPR-Cas9活性对于避免脱靶活性至关重要。噬菌体Acr蛋白的发现提供了一种限制Cas9功能的方法，以便更好地控制CRISPR实验，特别是对于未来的基因治疗程序。研究表明，通过光激活和基于shield1的系统可以控制CRISPR-Cas9活性，在该系统中，不稳定的AcrIIA4在添加小分子shield1后变得稳定。每种系统都有其优点和缺点。使用光可以控制群体中哪些特定细胞甚至在细胞内的亚细胞定位接收蛋白质激活，但是光激活并不是大多数实验室可用的技术，并且对于需要光暴露的体内模型来说应用有限。不稳定的AcrIIA4版本需要持续添加shield1来产生Acr活性，这在细胞培养和体内系统中可能具有毒性。相比之下，我们的Cas-ACROBAT系统无需持续添加小分子即可提供Acr活性，并能够控制何时关闭AcrIIA4功能以诱导CRISPR活性。

在大肠杆菌中的研究表明，核糖开关调节的sgRNAs可以控制CRISPR功能，从而提高转化和编辑效率，从而实现组合基因编辑。也有人尝试使用茶碱激活的sgRNAs在HEK293T细胞中控制CRISPR，但这些仅在控制CRISPRi方面成功，而未能实现基因编辑。在我们的实验中，我们使用了相同的茶碱浓度，并观察到了CRISPR基因编辑和CRISPRa的诱导。这种差异的一个可能原因是我们的细胞系HCECs比HEK293Ts更好地吸收茶碱，这可能允许更好的sgRNA切割。我们展示了通过在人类细胞中将degron融合的AcrIIA4 Acr蛋白与核糖开关调节的sgRNAs结合，我们可以使用dTAG或SMASh标签的degron系统将CRISPR切割活性限制在95%–98%，同时防止了过早的CRISPRa诱导（图4B–4E），而不牺牲效力。

我们的三种AcrIIA4融合系统各有独特特点，使其成为用户实验设计的最佳选择。dTAG架构非常适合需要高分辨率时间跟踪的体外应用，因为它在化合物添加后一小时内就能迅速激活Cas9活性（图S1B）。其主要限制是依赖于合成的配体dTAG-13，这是一种较大的二价分子，在临床相关性和合成成本方面不如TMP或asunaprevir。另一方面，SMASh系统对于需要“正向门”系统（配体开启Cas9）的体内疾病模型或转化研究非常有利。它使用价格合理的、临床批准的抗病毒药物asunaprevir，但由于依赖于预先存在的、已被切割的Acr蛋白的清除和衰减，其动力学窗口较慢（图3F）。ecDHFR框架提供了一个“反向门”（配体关闭Cas9），使用广泛可用且廉价的临床批准抗生素TMP。它最适合需要活性CRISPR状态的发育生物学或稳态分析，尽管需要持续添加化合物来维持系统抑制状态。最后，虽然这些独立的degrons足以处理无毒的、非必需的目标，但强烈建议将degron框架与我们框架互补的riboswitch sgRNA结合起来，形成完整的Cas9-ACROBAT系统，以最大限度地减少背景泄露。当调控必需的细胞周期调节因子（如PLK1或CCND1）或进行高保真筛选时，完整的Cas9-ACROBAT平台非常有益，因为即使是微量的基线编辑也会干扰表型解读。Cas9-ACROBAT系统相比传统的可诱导CRISPR方法（如doxycycline依赖的(Tet-On) Cas9或可诱导的U6-sgRNA表达盒）具有优势。转录诱导系统本身受到从头转录、翻译以及160-kDa Cas9蛋白核定位所需时间的限制，这可能需要几天才能达到完全诱导。即使是在紧密抑制的启动子中，Cas9转录本的泄露也会导致活性Cas9的缓慢积累，从而在长时间内逐渐引发编辑效应，特别是在诱导双链断裂的实验中。Cas9-ACROBAT通过在翻译后和转录后水平上操作来克服这些瓶颈。通过将Cas9和sgRNAs维持在预翻译但生化锁定的构象中，该系统实现了严格的基线抑制和快速的激活动力学。

对于任何可诱导的基因组工程平台来说，一个重要的考虑因素是其对编辑 fidelity（准确性的影响）。尽管我们的研究主要评估了靶向性能，但Cas9-ACROBAT平台的结构和动力学特性本身就旨在减少非靶向编辑。先前的研究表明，非靶向切割事件的发生率通常低于靶向事件，并且在高浓度活性Cas9积累的情况下会加剧。使用双层的翻译后AcrIIA4 degron和转录后sgRNA riboswitch屏蔽机制，Cas9-ACROBAT确保活性Cas9-sgRNA复合物仅在精确的用户定义的诱导窗口期间存在，这种机制可以通过 Withdrawal 配体来逆转。通过这种方式限制活性Cas9的寿命，可以最小化非靶向切割的机会，同时不牺牲靶向效力，使Cas9-ACROBAT成为提高基因组编辑 fidelity 的有前途策略。

将多组分合成电路转化为可行的治疗或体内编辑模型需要仔细优化基因传递和小分子的安全性。虽然与其他编辑平台相比，多个组分（Cas9、修改的sgRNAs和标记的AcrIIA4）的需求增加了复杂性，但我们通过设计一体化的双载体质粒来最小化这一障碍，这些质粒通过自切割T2A肽将Acr degron直接连接到Cas9表达（见图S1A）。这将平台简化为一种实用的两载体传递配置，完全兼容标准的基于慢病毒的基因传递。对于非慢病毒传递，虽然单个腺相关病毒（AAV）载体的包装限制约为4.7 kb，无法携带像dCas9-VPR这样的大型效应器，但双AAV系统可以将Cas9载体与degron标记的AcrIIA4和riboswitch sgRNA盒分开，提供了一种替代方案。非病毒平台如脂质纳米颗粒（LNPs）和类病毒颗粒（VLPs）也是可能的替代方案。使用LNPs（mRNA/sgRNA）或VLPs（预组装的RNPs和degron-AcrIIA4）进行非病毒传递，可以在不需要稳定基因组整合的情况下实现ACROBAT控制的CRISPR活性。我们选择的诱导剂配体进一步增强了Cas9-ACROBAT在体内使用的潜力。除了临床前工具化合物dTAG-13外，主要使用的小分子（asunaprevir、trimethoprim和theophylline）都是FDA批准的治疗药物，具有成熟的体内药理学和安全性特性。因此，Cas9-ACROBAT广泛适用于在细胞或动物模型中研究疾病的时间机制，并且也有助于推进临床中可控的高保真基因治疗。

Cas9-ACROBAT是一个易于使用、用户友好的工具，可以帮助研究人员通过CRISPR-Cas9控制基因表达。Cas9-ACROBAT系统提供了对CRISPR活性的更精确控制，是不断增长的CRISPR工具箱中的一个重要补充。

**研究的局限性**
尽管Cas9-ACROBAT平台提供了对CRISPR-Cas9功能的多层次控制，但仍存在一些局限性。首先，由于我们的门控机制依赖于AcrIIA4与spCas9之间的相互作用，当前框架仅限于spCas9变体。要将这一策略适应于其他流行的基因组工程效应器（如SaCas9、Cas12a或RNA靶向的Cas13系统），需要识别和验证兼容的ortholog-specific Acr蛋白以及定制的riboswitch支架结构。其次，病毒载体的遗传大小限制了对治疗应用的转化。尽管我们的设计将平台整合成了一个可管理的双载体格式，但大型转录激活剂或抑制剂融合体（如dCas9-VPR）与degron标记的AcrIIA4方法的结合超出了单个AAV载体的包装能力，可能需要在原代细胞和体内环境中使用双AAV载体或纳米颗粒介导的传递。第三，虽然限制Cas9的活性寿命已被证实可以减少非靶向基因组编辑，但本研究评估的是靶向效力、表型输出和靶向位点的泄漏抑制情况，而不是进行全面的全基因组非靶向分析。ACROBAT系统限制非靶向编辑的有效性仍有待确定。

**资源可用性**
关于进一步信息和资源的联系应联系首席联系人Stephen J Elledge ([e-mail])，他将提供所需的支持。

**材料可用性**
本研究中使用的所有带有详细图谱的质粒将由首席联系人Stephen J Elledge ([e-mail]) 共享。

**数据和代码可用性**
• 本文报告的所有数据将在需要时由首席联系人提供。
• 本文未报告原始代码。
• 如需重新分析本文中的数据，可从首席联系人处获取任何额外信息。

**致谢**
我们感谢Elledge实验室的所有成员提供的有益反馈和讨论。T.D.M.获得了Damon Runyon癌症研究基金会的奖学金（DRC 2199-14）的支持。E.V.W.获得了Damon Runyon癌症研究基金会的奖学金（DRG-2269-16）的支持。B.N.获得了美国癌症协会的博士后奖学金（PF-17-010-01-CDD）的支持。这项工作得到了Katherine L.和Steven C. Pinard研究基金对B.N.和N.S.G.的支持，以及NCI的R01CA234600资助、Cancer UK Grand Challenges Award和Mark Foundation For Cancer Research的资助。S.J.E.是Howard Hughes Medical Institute的研究员。

**作者贡献**
T.D.M.、E.V.W.、Y.W.、G.E.、K.C.、M.T.M.和S.J.E.共同构思了这项研究并设计了实验；T.D.M.、Y.W.、K.C.和M.Y.C.进行了所有实验；E.V.W.设计并克隆了受riboswitch/ribozyme控制的sgRNA构建体；Q.X.设计并克隆了GFP CRISPR激活报告基因；B.N.和N.S.G.提供了试剂；T.D.M.、E.V.W.、M.T.M.和S.J.E.在其他作者的支持下撰写了手稿。

**利益声明**
B.N.是与dTAG系统相关的专利申请的发明人（WO/2017/024318、WO/2017/024319、WO/2018/148440和WO/2018/148443）。Nabet实验室收到了Mitsubishi Tanabe Pharma America, Inc.的研究资助。B.N.和N.S.G.是与dTAG系统相关的专利申请的发明人（WO/2020/146250）。N.S.G.是Syros、C4、Allorion、Lighthorse、Voronoi、Inception、Matchpoint、Cobro Ventures、GSK、Larkspur（董事会成员）和Shenandoah（董事会成员）的创始人、科学顾问委员会成员和股权持有者。Gray实验室收到了Novartis、Takeda、Astellas、Taiho、Jansen、Kinogen、Arbella、Deerfield、Springworks、Interline和Sanofi的研究资助。S.J.E.是TScan Therapeutics和Immunity Bio的创始人兼科学顾问委员会成员。

**在手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的情况**
在准备本手稿的过程中，作者使用了Google Gemini进行校对并帮助提高内容的简洁性。作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

**方法**
**关键资源表**
| REAGENT 或 RESOURCES | SOURCE | IDENTIFIER |
|-------------|--------|-----------|
| Antibodies | Sigma | Cat# V9131; RRID: AB_477629 |
| | Roche | Cat# 12013819001; RRID: AB_390917 |
| PLK1 | Cell Signaling | Cat# 4513; RRID: AB_2167409 |
| Beta Actin | Cell Signaling | Cat# 3700; RRID: AB_2242334 |
| GFP | Cell Signaling | Cat# 2956; RRID: AB_1196615 |
| Phospho-Histone H2A.X Ser139 | Cell Signaling | Cat# 9718; RRID: AB_2118009 |
| FLAG-HRP | Cell Signaling | Cat# 2044; RRID: AB_10707327 |
| Cyclin D1 | Cell Signaling | Cat# 55506; RRID: AB_2827374 |
| CDKN1A/p21 | Millipore | Cat# OP64; RRID: AB_2335868 |
| GAPDHS | Santa Cruz | Cat# sc-365062; RRID: AB_10847862 |
| Alexa Fluor 647 CD146 | R&D Systems | Cat# NBP3-11488AF647; RRID: AB_3579064 |
| Goat anti-mouse HRP | Jackson Immuno | Cat# 115–035–044; RRID: AB_2338503 |
| Goat anti-rabbit HRP | Jackson Immuno | Cat# 111–035–003; RRID: AB_2313567 |

**实验模型和研究参与者详情**
**细胞培养**
人类结肠上皮细胞（HCECs）来自Dr. Jerry Shay（UT-Southwestern），并按指示进行培养。人类胰腺nestin阳性上皮细胞（HPNEs）已有描述。HEK293T和A-375来自ATCC，并在添加了10%胎牛血清（FBS，HyClone）和1%青霉素/链霉素（Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在37°C和5% CO2的湿润培养箱中培养。所有细胞在使用前都经过了支原体检测（Lonza，目录号LT07-218）。

**方法细节**
**稳定细胞系的生成**
为了生成稳定细胞系，我们使用293T细胞包装了带有psPax2和pMD2.G第二代包装质粒的VSV-G伪型慢病毒。293T细胞以每孔875,000个细胞的密度接种在6孔板上，1天后转染1.2微克的慢病毒转移质粒、0.6微克的psPax2和0.3微克的pMD2.G。质粒加入200 mL的OptiMEM中，并加入5.4 mL的PolyJet转染试剂。转染混合物在室温下涡旋混合30分钟后加入293T细胞。第二天，更换转染后的293T细胞的培养基。转染48小时后，收集病毒上清液并通过0.45 μm PES注射器过滤器过滤。向目标细胞中加入不同量的慢病毒（100、300、500和1000 mL），并加入8微克/mL的polybrene以辅助感染。感染24小时后，细胞切换到含有200微克/mL hygromycin的选择培养基。选择培养基持续到阴性对照（未感染的孔）完全死亡，这通常需要大约一周的时间。我们根据病毒稀释系列和存活细胞的数量选择了经过选择的细胞用于所有实验。

**增殖测定**
增殖测定是在96孔板中以每孔1,000个细胞的密度接种CellTiter Blue（Promega，目录号G8081），并在指定的时间段内使用PerkinElmer Victor X5计数器（目录号#2030）和Alamar blue设置进行计数。

**其他试剂**
以下cDNAs从Addgene获得，相应的质粒如下：AcrIIA4（pJH376，质粒#86842）、T2A-spCas9（pRubiG-T2A-Cas9，质粒#75348）、dCas9-VPR（SP-dCas9-VPR，质粒#63798）、dCas9-KRAB（pLV-dCas9-KRAB-PGK-HygR，质粒#83890）、dTomato报告基因系统（M-tdTom-SP，质粒#48677）以及氨基末端SMASh标签（pCS6-SMASh-YFP，质粒#68852）。AcrIIA4被克隆到pENTR dTOPO中，SMASh或dTAG结构域通过Gibson组装（Clontech，目录号#638909）插入以与AcrIIA4框对齐。不同的Cas9变体通过T2A序列连接到SMASh或dTAG融合的AcrIIA4，然后通过LR克隆酶（Invitrogen，目录号#11791-020）进一步克隆。riboswitch/ribozyme序列已先前描述。dTAG-13按先前描述的方法合成。CAG-dCas9-KRAB-LoxP-sEF1α-Puro-mCherry、CAG-dCas9-KRAB-DHFR-Acr-LoxP-sEF1α-Puro-mCherry（1x和2x degron）、sEF1α-dCas9-KRAB-Blast、sEF1α-dCas9-KRAB-Blast-DHFR-Acr、sEF1α-Cas9-Blast、sEF1α-Cas9-Blast-DHFR-Acr（1x和2x degron）、U6-sgRNA-sEF1α-Puro-mCherry-DHFR-Acr（1x和2x degron）质粒通过NEB HiFi组装（NEB）克隆。GFP报告基因质粒通过infusion组装（BioTools）克隆。所有克隆过程中均使用Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix（Thermo）进行PCR，然后进行琼脂糖凝胶电泳。提取了预定大小的DNA片段，并使用NucleoSpin凝胶和PCR清洁试剂盒（Machery-Nagel）进行了纯化。在HiFi组装或转染后，通过热休克将质粒转化为Stbl3大肠杆菌，并进行平板培养；随后使用QIAamp DNA Mini试剂盒（Qiagen）从菌落中提取质粒DNA。

生成带有诱导型CRISPRi系统的HEK293T细胞，该系统被敲入AAVS1位点。通过使用NsiI（NEB）在37°C下切割dCas9-KRAB-DHFR-Acr质粒30分钟使其线性化。对于转染，每个12孔板的孔中接种1.5 × 10^5个HEK293T细胞，并按照制造商的说明使用JetPrime转染试剂进行转染。将400 ng的线性化载体和400 ng的sgAAVS1-wtCas9质粒转染到HEK293T细胞中。转染三天后，将细胞分到10厘米的培养皿中，并向培养基中加入2 μg/mL的嘌呤霉素，未转染的细胞作为阴性对照。感染50 μL的sgCD146慢病毒后，挑选单个菌落并检测其CRISPRi活性。感染六天后，用Alexa Fluor 647 CD146抗体（R&D systems）对细胞进行染色，并使用Attune NxT流式细胞仪（Thermo）测量CD146的表达。选择CD146表达受到抑制的克隆。

对于Cre治疗，每个12孔板的孔中接种1.5 × 10^5个经过验证的克隆细胞，并按照制造商的说明使用JetPrime转染试剂进行转染。将800 ng的Cre质粒（Addgene质粒#24971）转染到这些克隆中。每隔一天将克隆分次培养一周，并通过流式细胞术评估mCherry信号。由于存在mCherry阴性的细胞群体，因此对整个群体进行连续稀释以生成单细胞克隆。每个克隆都经过mCherry丢失和嘌呤霉素敏感性的验证，并感染sgCD146慢病毒，然后按照上述方法测量CD146的表达。选择表现最佳的克隆。

使用ecDHFR-AcrIIA4 CRISPRi系统测量GFP和CD146的表达。每个12孔板的孔中接种1.5 × 10^5个经过验证的可诱导HEK293T细胞，并用含有10 μM TMP的GFP报告基因sgRNA、非靶向对照（NTC）sgRNA或CD146 sgRNAs（sgCD146 #1或#2）慢病毒进行转染。野生型细胞也用GFP报告基因慢病毒进行转染作为阳性对照。转染两天后，将细胞分成两组，一组接受10 μM TMP，另一组接受0 μM TMP。之后每隔一天调整TMP浓度进行培养，并使用Attune NxT流式细胞仪（Thermo）测量GFP或CD146的表达。对于CD146，用Alexa Fluor 647 CD146抗体（R&D systems）进行染色。

使用ecDHFR-AcrIIA4 CRISPRi系统进行TMP剂量反应实验。dCas9-KRAB和ecDHFR-AcrIIA4敲入的HEK293T细胞用sgCD146 #1、sgCD146 #2、sgNTC或针对GFP报告基因的sgRNA进行转染。转染后的细胞在含有hygromycin的培养基中培养，直到阴性对照组完全死亡，然后在10 μM TMP中维持一周。在这种浓度下连续培养六天后，将细胞分到含有不同TMP浓度的新鲜培养基中（0 μM、10 nM、25 nM、50 nM、75 nM、100 nM、1 μM），每种浓度重复三次。第六天，用Alexa Fluor 647 CD146抗体（R&D systems）对细胞进行染色，或在Attune NxT流式细胞仪上进行分析（通过 gating选择活的单细胞）。

**Western blotting和抗体**
所有细胞在1x RIPA裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate和0.1% SDS，Boston Bioproducts，产品编号#BP-115X）中裂解，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Thermo，产品编号#78440）。蛋白质通过Bradford测定法（Bio-Rad，产品编号#500-0006EDU）进行定量。蛋白质裂解物与4X还原样本缓冲液（Invitrogen，产品编号#NP0007）混合后，通过4–12% Bis-Tris凝胶（Thermo，产品编号#NP0336BOX）分离，并通过Trans-Blot Turbo Transfer System（Bio-Rad，产品编号#1704150）转移到硝酸纤维素膜上（Bio-Rad，产品编号#170–4158）。膜在室温下用5%牛奶在TBST中封闭1小时（Santa Cruz，产品编号#sc-362311），然后在5% BSA（VWR，产品编号#VWRV0332）中加入以下抗体进行孵育，孵育时间可在4°C下过夜或在室温下1小时：Vinculin（1:10,000，产品编号#V9131）、HA-HRP（1:1,000，产品编号#12013819001）（Sigma）、PLK1（1:1,000，产品编号#4513T）、β-actin（1:10,000，产品编号#3700S）、GFP（1:1,000，产品编号#2956S）、Phospho-Histone H2A.X Ser139（1:1,000，产品编号#9718S）和FLAG-HRP（1:1,000，产品编号#2044S）（Cell Signaling）、CDKN1A/p21（1:1,000，产品编号#OP64）（Millipore）以及GAPDH（1:10,000，产品编号#sc-365062）（Santa Cruz）。使用山羊抗鼠或兔HRP结合的二次抗体（1:5,000，产品编号#s31430和31460）在室温下孵育1小时，通过ECL（PerkinElmer，产品编号#NEL104001EA）和LI-COR（Odyssey型号#2800）或HyBlot CL（Denville Scientific，产品编号#1159M38）进行检测。

**流式细胞术**
细胞通过胰蛋白酶处理并使用0.35 μm细胞过滤器（Falcon，产品编号#352235）过滤，以确保获得单细胞悬浮液。样品在LSR II流式细胞仪（Becton-Dickinson）上进行分析。活的单细胞分别通过SSC-A和FSC-A进行 gating。GFP使用488 nm激光和FITC滤光片检测，dTomato使用568 nM激光和PE滤光片检测。

**定量和统计分析**
两组之间的差异使用Prism（Graphpad）中的非配对双尾学生t检验确定。所有实验的误差条表示标准误差（S.E.M），星号（?）表示p值<0.05。所有实验均重复至少两次或三次，总共至少进行了两次独立的实验，这些实验在不同的日期进行。

**补充信息（2）**
下载所有文件：
- 文档S1：图S1–S5和表S1（PDF格式，744.36 KB）
- 文档S2：文章及补充信息（PDF格式，5.80 MB）