无支架旋转细胞培养系统规模化制备功能趋同的围产期间充质基质细胞球体并增强其促再生效能

《Journal of Tissue Engineering》：A scaffold-free rotary culture system enables scalable production of functionally convergent perinatal MSC spheroids with enhanced pro-regenerative potency

间充质基质细胞球体（MSC_sp）是再生医学中具有前景的生物活性构建体；然而，用于跨不同组织来源生成功能增强且一致的MSC_sp的可规模化无支架方法仍然有限。在此，研究人员评估了一种基于旋转细胞培养系统（RCCS）的动态三维（3D）平台，用于使用来源于羊膜（AM）、脐带（UC）和胎儿胎盘（FP）的间充质基质细胞（MSC）可规模化生成MSC_sp。第2天收获的RCCS-MSC_sp表现出紧凑形态、均一尺寸、高活力和改善的线粒体功能。与单层MSC和悬滴球体相比，RCCS-MSC_sp显示凋亡降低、抗氧化能力增强以及细胞外基质（ECM）沉积增加。转录组分析揭示，跨MSC来源存在免疫调节、血管生成、细胞外基质和组织修复程序的保守性激活。在功能上，RCCS-MSC_sp通过增强血管化和组织重塑促进内皮保护、巨噬细胞极化和糖尿病创面修复。此外，RCCS介导的球体形成部分降低了围产期MSC中来源相关功能变异性。本研究提供了一种可规模化无支架3D生物工程策略，用于生成标准化、功能增强的MSC球体，以用于转化再生应用。

研究背景：间充质基质细胞（MSC）因具有免疫调节、促再生和营养支持作用，并具有低免疫原性和低致瘤性的良好安全性，被视为免疫介导疾病和组织修复的治疗候选。目前多数临床前和临床MSC产品通过二维塑料贴壁扩增后酶解获得单层培养解离MSC（MC-MSC_diss），但长期单层扩增和反复解离可能损害MSC活力，增加细胞应激和衰老，最终削弱治疗效能；不同组织来源MSC还存在明显生物学和功能异质性，可能导致治疗结果不一。移植后存活差、滞留有限以及对恶劣炎症或缺血微环境适应不足，也限制MSC治疗转化。因此，开发既增强MSC效能又提高产品一致性的制造策略是再生医学的重要挑战。将MSC工程化为三维球体（MSC_sp）可更好保留细胞间相互作用并重现三维微环境，增强存活、抗应激、免疫调节、血管生成和旁分泌。但MSC球体转化仍受限于可规模化、可重复、无支架且质量可控、并能在不同MSC来源中系统验证的生产策略。悬滴法虽可较好控制初始细胞数和球体尺寸，但费力、低通量且难以大规模生产；低黏附培养尺寸和数量较难控制；生物材料辅助会增加制造复杂性、批间变异和安全性顾虑。无支架动态悬浮培养可避免辅助生物材料并支持连续运动下的大规模聚集，但不同动态平台的流体力学、剪切、碰撞频率和传质条件不同，可影响球体形成动力学、尺寸、活力和表型；既往研究多集中于单一组织来源或选定生物学特征，跨多种围产期MSC来源的系统比较仍有限。基于此，研究人员系统评估了RCCS这一旋转壁动态培养平台，用于羊膜（AM）、脐带（UC）和胎儿胎盘（FP）来源围产期MSC球体的可规模化生成，比较RCCS-MSC_sp、悬滴MSC球体（HD-MSC_sp）和MC-MSC_diss，并在高糖损伤人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、巨噬细胞极化和链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病小鼠全层皮肤创面模型中评估其促血管、免疫调节和组织修复能力。研究结论支持RCCS可作为可规模化、无支架且功能有效的策略，用于生产高质量生物活性围产期MSC球体，并部分降低来源相关功能差异。

关键技术方法（含样本来源）：研究使用3名独立健康供者的AM、UC和FP匹配组织分离MSC；动物实验使用C57BL/6J小鼠并构建STZ诱导糖尿病模型。关键技术包括：RCCS动态三维培养及球体形成动力学和收获时间评估；悬滴培养作为球体对照；流式细胞术检测表面标志、细胞周期、凋亡、活性氧（ROS）和线粒体膜电位；bulk RNA-seq与基因本体（GO）富集分析；免疫荧光；高糖损伤HUVEC共培养检测存活、EdU增殖、划痕闭合和成管；骨髓来源巨噬细胞（BMDM）极化实验；糖尿病小鼠全层皮肤创面模型及组织学、免疫荧光和创面RNA-seq分析。

研究结果：
1. RCCS可在三种围产期组织来源中高效且可规模化生成MSC球体。通过在第12小时及第1、2、3、5天采集UC-MSC来源RCCS球体，观察聚集过程、直径分布、Calcein/PI活力和TMRE线粒体膜电位，发现第2天球体形态致密、尺寸相对均一、活力高且线粒体膜电位保持较好；延长至第3、5天则尺寸异质性增加、PI阳性死亡细胞增多、膜电位下降，AM和FP来源表现类似。结论为第2天是兼顾紧凑形态、尺寸均一、高活力和线粒体活性的较佳收获窗口。

2. RCCS在围产期MSC来源中诱导保守的修复相关重塑。通过比较MC-MSC_diss、HD-MSC_sp和RCCS-MSC_sp，流式分析显示球体形成使凋亡和增殖分数降低，RCCS-MSC_sp较HD-MSC_sp进一步表现为凋亡减少、Rosup刺激后ROS积累降低和线粒体膜电位更好维持；转录组相关性和主成分分析显示HD-MSC_sp与RCCS-MSC_sp更接近，热图显示球体上调免疫调节（PTGS2、TNFAIP6）、血管生成（VEGFA、ANGPTL4）、ECM组织（COL7A1、TIMP1）、氧化应激反应（SOD2、GPX4）和凋亡调节（MCL1、BCL2A1）相关基因，并降低增殖相关基因；RCCS-MSC_sp较HD-MSC_sp富集细胞因子活化、氧化应激、免疫细胞趋化迁移、ECM组织和血管生成等过程。免疫荧光显示RCCS-MSC_sp中cleaved caspase-3⁺凋亡细胞更少、I型胶原沉积更多，Ki67在两组球体中均较低；同体积培养下RCCS产生更多球体且尺寸范围可比。结论为RCCS保留传统球体核心分子和功能优势，并进一步提高抗凋亡、抗氧化应激、ECM重塑和生产效率。

3. 与MC-MSC_diss相比，RCCS-MSC_sp增强内皮修复和促血管生成能力。通过将高糖处理HUVEC与三种来源MC-MSC_diss或RCCS-MSC_sp共培养，检测存活、EdU增殖、划痕闭合和Matrigel成管，发现RCCS-MSC_sp减少高糖诱导的HUVEC死亡，较MC-MSC_diss更有效促进增殖、划痕闭合和成管连接点增加；单层培养中AM-MSC_diss对划痕闭合和成管的作用强于UC和FP来源，而三种来源RCCS-MSC_sp效果更可比。结论为RCCS-MSC_sp增强高糖损伤下的内皮修复和促血管生成能力，并部分降低来源相关功能差异。

4. 与MC-MSC_diss相比，RCCS-MSC_sp增强M2样巨噬细胞极化。通过LPS和IFN-γ刺激BMDM形成M1样炎症表型，再与三种来源MC-MSC_diss或RCCS-MSC_sp共培养，免疫荧光检测F4/80和CD206，发现RCCS-MSC_sp较MC-MSC_diss更强地增加CD206⁺ M2样巨噬细胞；MC-MSC_diss中UC来源作用最强，而RCCS-MSC_sp组间来源差异减小。结论为RCCS介导球体形成增强围产期MSC免疫调节潜力并部分减弱来源相关功能异质性。

5. RCCS-MSC_sp加速糖尿病创面愈合并降低体内组织来源相关功能异质性。通过STZ诱导糖尿病小鼠建立全层圆形皮肤创面并加硅胶环，设置非糖尿病创面、糖尿病创面及三种来源MC-MSC_diss或RCCS-MSC_sp治疗组，动态成像并取创面组织行H&E和Masson染色，发现RCCS-MSC_sp较MC-MSC_diss加速创面闭合、减小第7天创面面积；MC-MSC_diss中FP来源修复作用相对有限，而三种来源RCCS-MSC_sp治疗效果更可比；H&E显示RCCS-MSC_sp改善创面覆盖、减小瘢痕宽度并减轻炎症浸润，Masson显示胶原沉积和ECM重塑增加。结论为RCCS-MSC_sp增强糖尿病创面修复能力并部分降低体内来源相关治疗差异。

6. RCCS-MSC_sp促进糖尿病创面免疫重塑和血管生成。通过对第7天创面组织进行bulk RNA-seq和免疫荧光，GO富集显示RCCS-MSC_sp治疗创面较对应MC-MSC_diss组富集负调控炎症反应、趋化因子和细胞因子活性、免疫反应、白细胞迁移、血管生成、ECM组织和组织重塑等过程；创面中M1相关基因Tnf、Il1r1、Il1b、Il1a、Il6、Nos2、Cxcl10、Nfkb1、Stat1、Il12b、Irf9表达降低，M2相关基因Il10、Mrc1、Cd163、Clec10a、Irf4表达升高；免疫荧光显示CD31⁺血管结构和F4/80、CD206信号增加，三种来源RCCS-MSC_sp表现类似。结论为RCCS-MSC_sp通过增强血管生成和重塑炎症创面微环境促进糖尿病创面修复，并在不同围产期来源中呈现较保守的促再生效应。

讨论总结：本研究并非提出旋转培养形成球体的全新概念，而是系统评估RCCS动态三维平台用于围产期MSC球体的规模化生产和功能表征。RCCS-MSC_sp保留球体相关优势，同时改善抗凋亡、抗氧化应激、ECM重塑和生产效率；该平台支持AM、UC和FP来源MSC成球，并部分减弱组织来源相关功能变异。与HD-MSC_sp相比，RCCS-MSC_sp在细胞因子活性、氧化应激反应、免疫细胞迁移、ECM组织和血管生成等过程富集更明显；体外内皮支持和M2样巨噬细胞极化结果与分子谱一致；糖尿病小鼠体内证实三来源RCCS-MSC_sp在创面闭合、胶原沉积和组织重塑方面优于MC-MSC_diss。转化方面，RCCS较悬滴培养更适合大体积生产，较生物材料辅助系统避免外源支架材料，可能简化制造并减少材料相关变异；既往非人灵长类研究报道MSC球体静脉移植的可行性和安全性，支持其转化潜力。局限包括：RCCS诱导分子重塑与功能增强之间的因果关系仍需验证；RCCS与悬滴培养在细胞加载形式、培养几何和聚集动力学方面不同，尽管悬滴条件已优化至尺寸范围大致可比，两种方法所得球体仍可能存在结构和细胞特征差异；仍需临床相关制造条件评估批间重现性、冻存稳定性、效力检测和长期安全性。

研究结论部分翻译：尽管存在这些局限性，研究人员的发现支持RCCS作为一种可规模化、无支架且功能有效的策略，用于生产高质量生物活性围产期MSC球体。这项工作提供了一种实用的动态3D生物工程策略，以提高MSC功能一致性并支持转化再生应用。