整合全基因组测序与宏基因组学提高猪脂肪沉积性状表型预测能力

《Genetics Selection Evolution》：Integrating whole-genome sequencing and metagenomics improves phenotype prediction of fat deposition traits in pigs

背景：脂肪沉积是影响猪生产效率与胴体品质的重要经济性状，受遗传与环境因素共同影响。尽管越来越多证据表明肠道微生物组对宿主表型变异有贡献，当前基因组评估与预测模型主要依赖宿主基因型信息，较少考虑微生物组效应。本研究旨在量化肠道微生物组对脂肪沉积性状的贡献，并评估整合微生物组信息能否改善猪的表型预测。结果：研究人员采集了478头杜洛克×长白×大白（DLY）猪的6个脂肪沉积性状（肩部背膘厚、第6-7肋背膘厚、最后肋背膘厚、腰部背膘厚、倒数第3-4肋背膘厚及平均背膘厚）的表型特征。利用全基因组重测序和宏基因组测序，研究人员鉴定出2100万个单核苷酸变异（SNV），并量化了478头猪中20336个肠道微生物物种的丰度。高脂沉积与低脂沉积猪之间观察到明显的粪便微生物群落结构差异，并鉴定出27个细菌物种作为与脂肪沉积相关的潜在生物标志物。6个背膘厚性状的微生物遗传力（microbiability）估计值为0.17至0.44，表明肠道微生物组在宿主遗传贡献之外解释了相当比例的表型变异。相比之下，宿主基因组与肠道微生物组之间的互作效应在6个性状中仅解释可忽略比例的表型变异。将整体微生物组信息纳入基因组预测模型后，平均表型预测能力为0.082至0.292，相较于加性遗传模型，各性状预测能力提高0.023至0.084，预测均方误差降低0.001至0.009。结论：研究结果表明，肠道微生物组对猪脂肪沉积性状变异有实质性贡献。整合宿主全基因组重测序与肠道宏基因组信息在表型预测能力上产生了适度的绝对增益，提示肠道微生物组可为猪复杂性状预测模型提供补充信息。

研究背景方面，猪肉是全球消费量最大的肉类，被视为优质蛋白质来源。皮下脂肪沉积通常以背膘厚（BF）为代理指标，直接影响生产效率和胴体品质。背膘过厚会降低胴体瘦肉率，并在遗传上与较差的饲料效率（以较高的饲料转化率体现）相关。因此，对背膘厚进行靶向遗传改良对养猪业具有重要实践意义。基因组选择（又称基因组预测）是一种现代育种方法，利用全基因组标记信息估计个体的基因组估计育种值（GEBV），可在动物生命早期无需自身表型记录即可进行评估，从而提高遗传评估准确性、缩短世代间隔并加速遗传进展。然而，目前猪的大多数研究集中于鉴定影响脂肪沉积的宿主遗传变异，基因组预测模型大多仅依赖宿主基因组数据。值得注意的是，动物是一个全生物体（holobiont），即由宿主生物及其微生物组构成的共生实体。复杂宿主性状的表达不仅受宿主自身遗传调控，也受肠道微生物群影响。在人类、小鼠和家畜中的研究已报道肠道微生物群与肥胖或脂肪沉积之间的关联。例如，在肥胖与瘦个体之间观察到厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度的差异，但这些门与肥胖的关联是否代表一致的微生物特征在各研究中仍存在争议。猪的初步研究表明特定肠道细菌可调节脂肪沉积，如埃希菌属（Escherichia spp.）在高脂沉积猪的空肠、回肠和盲肠中持续富集，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）通过增强支链氨基酸（BCAA）合成促进肌内脂肪沉积，而Siraeum真杆菌（Eubacterium siraeum）似乎通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制脂肪生成。受定量遗传学中遗传力概念的启发，"微生物遗传力"（microbiability）被提出用于量化微生物群解释的宿主表型变异比例。应用该框架的研究在不同物种中一致发现微生物群对复杂性状具有显著且很大程度上独立的贡献。这些发现使肠道微生物群数据成为预测复杂性状的有力补充资源。此外，宏基因组学和其他多组学方法不仅提供了新的预测视角，还揭示了仅靠基因组测序难以发现的表型-基因型关联。已有研究表明，将此类多组学数据纳入预测模型可改善遗传评估和预测准确性。本研究旨在探究DLY猪中宿主遗传、肠道微生物群与脂肪沉积性状之间的关系，具体目标为：（i）表征DLY猪中与脂肪沉积性状相关的肠道微生物组特征；（ii）估计宿主遗传效应、肠道微生物组效应及其互作对脂肪沉积性状变异的贡献；（iii）评估整合肠道微生物组信息能否改善脂肪沉积性状的表型可预测性。本研究为了解肠道微生物组对脂肪沉积的贡献以及探索整合微生物组信息的表型预测模型提供了基础。

研究人员开展了以下研究：共纳入478头DLY猪，由温氏食品集团股份有限公司（广东，中国）提供，在标准化管理下自由采食共同饲料和饮水。在约110±5 kg时采集耳组织样本并通过直肠拭子获取粪便样本，所有样本在液氮中速冻并保存于-80°C。随后所有猪按标准程序屠宰。使用游标卡尺测量不同解剖部位的背膘厚，包括肩部背膘厚（BF1）、第6-7肋背膘厚（BF2）、最后肋背膘厚（BF3）、腰部背膘厚（BF4）和倒数第3-4肋背膘厚（BF5），平均背膘厚（BF6）表示为肩部背膘、最后肋背膘和腰部背膘的均值以评估背膘均匀性。收集表型数据后，使用BLUPF90程序中的单性状动物模型对原始表型记录进行校正，模型包含性别（两个水平，公：母=1.03）、农场（四个水平）、批次（十三个水平）作为固定效应，日龄（176-229天）作为协变量。使用rMVP包可视化群体的表型分布。结论方面，研究结果表明肠道微生物组对猪脂肪沉积性状变异有实质性贡献，整合宿主全基因组重测序与肠道宏基因组信息在表型预测能力上产生了适度的绝对增益，提示肠道微生物组可为猪复杂性状预测模型提供补充信息。该研究为理解肠道微生物组对脂肪沉积的贡献提供了依据，并为探索整合微生物组信息的表型预测模型奠定了基础，对猪育种中整合多组学信息改善复杂性状预测具有参考意义。

在关键技术方法方面，研究人员采集了478头DLY猪（温氏食品集团股份有限公司提供）的耳组织和粪便样本，利用Illumina HiSeq 2500平台进行宿主全基因组重测序（产生150 bp双端读长）和粪便宏基因组测序（2×150 bp，平均深度6 Gb）。全基因组数据经BWA比对至猪参考基因组（Sus scrofa 11.1）、GATK进行SNP calling和质控，最终保留21,712,014个SNP。宏基因组数据经KneadData去除宿主序列、MEGAHIT组装、MetaGeneMark预测开放阅读框（ORF）、CD-HIT去冗余、DIAMOND比对NCBI非冗余蛋白数据库、Salmon进行基因定量，最终获得20,336个细菌物种的丰度矩阵。基于SNP数据构建基因组关系矩阵（GRM），基于物种丰度构建微生物关系矩阵（MRM）。使用HIBLUP软件拟合三种线性混合模型分别估计宿主遗传效应、微生物组效应及其互作效应，计算遗传力和微生物遗传力。采用五折交叉验证（重复5次）评估GBLUP和GMBLUP模型的预测能力（以预测值与校正表型值的Pearson相关系数衡量）和预测均方误差（MSEP）。

研究结果方面，第一，猪脂肪沉积性状的分布与遗传参数估计。研究人员对478头DLY猪5个部位测量了背膘厚（图1a），并将平均背膘厚作为脂肪沉积的表型性状。BF1均值最大（3.25 cm），BF4最小（1.61 cm）。所有性状表型分布符合正态分布，变异系数从BF1的25.34%到BF4的38.44%。利用全基因组重测序数据估计6个脂肪沉积性状的遗传参数，6个BF性状的遗传力估计值为低到中等（0.13至0.38），BF1遗传力最高。6个BF性状之间呈正相关，遗传相关系数为0.59至1.00。其中BF2与BF1、BF4和BF6呈高遗传相关，BF1与BF3之间遗传相关最低（0.59±0.18），表明肩部和最后肋背膘厚的遗传基础存在异质性。总体而言，BF6与其他BF性状呈高遗传相关，除与BF3的相关（0.85±0.07）外，BF6与其他BF性状的相关均在0.90以上（0.90±0.06至1.00±0.17）。鉴于BF6代表平均背膘厚且与其他部位背膘厚强相关，后续根据BF6值对猪进行分组。

第二，高脂沉积组与低脂沉积组之间微生物组成和多样性的比较。在478头猪中，研究人员将平均背膘厚（BF6）最高10%和最低10%的个体分别定义为高背膘（High_bf）组和低背膘（Low_bf）组，即选取脂肪沉积最高（BF6值：3.46±0.26 cm）和最低（BF6值：1.22±0.16 cm）的各47头猪。两组BF6值差异显著（p<0.001）。基于微生物分类注释，在门水平，厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门和变形菌门是DLY猪粪便微生物群中的优势门，其中厚壁菌门和拟杆菌门合计占总群落的83.9%。厚壁菌门在高背膘组中比例高于低背膘组（49.1% vs. 46.7%），而拟杆菌门呈相反模式（34.5% vs. 37.7%）。在属水平，普雷沃氏菌属（Prevotella）、密螺旋体属（Treponema）、拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）和梭菌属（Clostridium）是两组中丰度最高的五个属，平均相对丰度分别为19.8%、4.5%、4.3%、3.7%和3.6%。普雷沃氏菌属在高背膘组占18.9%、低背膘组占20.7%，而乳杆菌属分别占1.9%和5.5%。在种水平，Prevotella copri、Limosilactobacillus reuteri和Lactobacillus johnsonii是所有样本中丰度最高的三个物种。比较两组微生物群的α多样性，高背膘猪的Shannon指数显著高于低背膘猪（p<0.01），Simpson指数在两组间也差异显著（p<0.01）。基于Bray-Curtis距离的β多样性经PCoA可视化，PERMANOVA表明高背膘组与低背膘组之间物种组成差异显著，分组效应解释总变异的5.44%（R2=0.0544，p<0.01）。为鉴定两组间差异丰度的特定细菌，研究人员对LDA评分大于2的分类群进行LEfSe分析。在门水平，6个门分别为各脂肪沉积组的特征，高背膘组为纤维杆菌门（Fibrobacteres）、软壁菌门（Tenericutes）、疣微菌门（Verrucomiceobia）、 lentisphaerae门和浮霉菌门（Planctomycetes），低背膘组为衣原体门（Chlamydiae）。在属水平，高背膘组17个属（包括Bullifex、纤维杆菌属、Lachnoclostridium和厌氧支原体属）和低背膘组4个属（包括月形单胞菌属、Prevotellamassilia、Holdemanella和衣原体属）被鉴定为潜在生物标志物。在种水平，低背膘组7个物种（包括3个普雷沃氏菌属物种）和高背膘组20个物种（包括2个密螺旋体属物种和1个拟杆菌属物种）被认为是不同脂肪沉积的潜在生物标志物。总之，这些发现揭示了高脂沉积与低脂沉积猪之间不同的微生物特征，突出了可能影响宿主能量获取和脂肪积累的特定分类群。

第三，宿主遗传和肠道微生物群解释的脂肪沉积变异比例。为量化宿主加性遗传和肠道微生物群对猪脂肪沉积性状的贡献，研究人员进一步获取了全部478头实验个体的粪便微生物群图谱，将宿主遗传和肠道微生物组同时建模为总表型变异的组成部分，估计了6个BF性状的遗传力和微生物遗传力。6个BF性状的微生物遗传力估计值为0.17至0.44，表明肠道微生物群对这些性状有实质性贡献。为探究宿主基因组相似性是否与肠道微生物群组成相似性相关，研究人员进行了Mantel检验以检查GRM与MRM之间的关联，检测到GRM与MRM之间显著相关（Mantel统计量r：0.075，p值：0.001），提示宿主遗传亲缘关系与整体微生物组相似性相关。然而，这种矩阵水平的对应并不直接表明宿主遗传效应与微生物组效应互作影响表型变异。为进一步评估这种对应是否通过互作效应贡献于表型变异，研究人员在扩展模型（模型C）中纳入互作项。结果显示6个性状的宿主基因组和微生物组效应与模型B基本一致。互作效应解释的变异仅占总表型变异的很小部分（0.1%~0.6%），表明在当前群体中未检测到宿主基因组与肠道微生物组之间对脂肪沉积性状有显著贡献的互作效应。

第四，利用基因组和微生物组信息对脂肪沉积性状的表型预测。基于全基因组测序和宏基因组数据，研究人员评估了整合宿主基因组和微生物组信息能否改善BF性状的表型预测。在标准GBLUP模型下，6个性状的平均预测能力为0.059至0.208，中位数为0.044至0.208。当模型同时纳入基因组和微生物组信息时，GMBLUP对BF1至BF6的平均预测能力分别为0.242、0.082、0.241、0.201、0.213和0.292，相应中位数为0.234、0.086、0.247、0.209、0.211和0.321。与GBLUP相比，GMBLUP在各性状上平均预测能力提高0.023至0.084，对应BF1至BF6的相对提高分别为24.7%、38.9%、26.2%、14.2%、36.5%和40.3%。提高幅度因性状而异，BF6增幅最大。为进一步评估预测误差，研究人员计算了每个验证折的预测均方误差。GBLUP下平均MSEP为0.167至0.347，GMBLUP下为0.164至0.339。与GBLUP相比，GMBLUP在6个性状上平均MSEP略微降低0.001至0.009。这些结果表明，整合微生物组信息适度改善了BF性状的表型预测能力并略微降低了预测误差。

讨论部分总结如下：脂肪沉积是受遗传和环境共同影响的复杂数量性状。随着微生物组研究的进展，肠道微生物组已被证明能解释许多不同家畜物种中复杂性状的部分表型变异。基于宏基因组测序，研究人员揭示了高脂沉积与低脂沉积猪之间肠道微生物群组成的差异。厚壁菌门和拟杆菌门是粪便微生物群中的优势门，合计平均占总丰度的83.9%，与先前研究一致。此外，螺旋体门和变形菌门也是DLY猪粪便微生物群的主要组成部分。在属水平，两组中丰度最高的十个分类群基本相似，普雷沃氏菌属、密螺旋体属、拟杆菌属和乳杆菌属位居最普遍之列。然而需要指出的是，优势属可能因猪品种而异，可能源于遗传和环境差异。先前猪肠道微生物群研究大多利用16S rRNA基因测序，因其成本较低，但该方法通常仅提供至属水平的分类分辨率。相比之下，宏基因组测序捕获全部基因组内容，允许在种甚至菌株水平更精确地鉴定微生物分类群。利用该方法，研究人员在DLY猪中鉴定出若干感兴趣的细菌物种，如Prevotella copri、Limosilactobacillus reuteri和Lactobacillus johnsonii。值得注意的是，Lactobacillus johnsonii已被认为参与糖转运和代谢，并有助于维持肠道稳态。为进一步鉴定DLY猪中与脂肪沉积相关的潜在生物标志物，LEfSe鉴定出高背膘组与低背膘组之间差异丰度的27个细菌物种。若干普雷沃氏菌属相关物种（包括Prevotella copri、Prevotella hominis和Prevotella sp. AM42-24）在低背膘组中富集。普雷沃氏菌属物种是猪肠道微生物群的常见成员，参与碳水化合物发酵和发酵衍生代谢物的产生。P. copri在人类和小鼠研究中被报道与肥胖呈负相关，而一项在杜洛克猪中的研究报告P. copri在配方饲料下与脂肪积累增加相关。这些不一致的发现表明P. copri与脂肪沉积之间的关系可能具有环境依赖性。在高背膘组中，若干富集物种属于与复杂碳水化合物降解或纤维利用相关的分类群，包括密螺旋体属和拟杆菌属相关物种。密螺旋体属与猪的纤维消化率相关，拟杆菌属相关分类群具有广泛的膳食多糖利用能力。这些分类群可能反映了不同脂肪沉积水平猪之间微生物底物利用的差异。尽管如此，所鉴定的物种应被视为脂肪沉积相关的微生物特征而非因果生物标志物，需要进一步的微生物功能分析和实验验证以确定这些物种是否直接促进猪的脂肪积累。微生物遗传力提供了肠道微生物组对脂肪沉积性状表型变异贡献的定量度量。本研究利用DLY猪粪便样本的宏基因组测序数据，基于种水平相对丰度构建了个体间MRM，应用同时考虑宿主遗传效应和微生物组效应的线性混合模型估计6个脂肪沉积性状的微生物遗传力，得到0.17至0.44的值。这些结果表明肠道微生物组解释了相当比例的表型变异。较高的微生物遗传力估计值提示微生物组对性状变异的贡献较大，表明肠道微生物组信息有助于解释脂肪沉积性状的变异。先前基于不同肠道段微生物群落的研究估计值为0.11至0.31。在通城×大白猪中的研究报道背膘厚的微生物遗传力为0.11~0.20，略低于该性状的遗传力。相比之下，He等观察到微生物遗传力估计值为0.42。研究间的差异可能反映品种、管理条件、肠道采样部位和测序方法的不同。此外，MRM的构建需要仔细考虑，因为微生物组相对丰度数据是成分性的，不同的微生物组丰度数据转换和标准化策略可能强调微生物群落变异的不同方面，从而可能影响个体间基于微生物组的关系估计。因此，跨研究的微生物遗传力比较应谨慎解释。先前大多数研究依赖基于OTU的微生物组图谱，其分类分辨率低于宏基因组数据。通过利用种水平信息，本研究提供了基于宏基因组数据的猪脂肪沉积性状微生物遗传力的经验估计。上述仅关注单一效应，即仅关注宿主基因组或微生物群的独立影响。然而，宿主遗传是否可能与肠道微生物群互作影响猪脂肪沉积在很大程度上仍未知。考虑到宿主遗传对肠道微生物组的潜在影响，研究人员在混合模型中纳入宿主基因组与微生物组之间的互作效应以评估其对表型变异的贡献。结果表明这些互作效应解释的变异接近于零，与先前报道一致。本研究相对有限的样本量可能降低了检测微小互作效应的能力。因此，本数据集中缺乏统计学支持的互作效应并不能证明此类互作在生物学上不存在，需要更大群体以更可靠地评估互作。Mantel检验常用于微生物组研究以评估宿主遗传与肠道微生物群组成之间的相关性。本研究中检测到宿主基因组亲缘矩阵与肠道微生物群关系矩阵之间显著相关（r=0.075），与人类和小鼠中的观察一致。然而，Mantel检验在评估宿主遗传对整体微生物组结构影响时具有固有局限性。作为一种基于矩阵的方法，它主要捕获线性关系，可能忽略非线性互作。此外，肠道微生物群具有高度复杂性且其间存在互作，可能影响观察到的相关强度。因此，尽管检测到的相关较弱，但提示宿主遗传背景与肠道微生物群组成之间存在有限关联。动物育种的进步部分依赖于在基因组选择中整合新的预测指标以提高复杂性状的准确性。除基因组数据外，微生物组丰度图谱也可作为预测猪复杂性状的信息来源。先前研究表明，仅基于微生物组数据的预测模型可能优于传统基因组预测模型。然而，大多数现有研究局限于宿主基因组或微生物组数据之一，缺乏两个组学层面的系统整合。为此，本研究在预测模型中整合了宿主基因组和肠道宏基因组信息，评估了猪脂肪沉积性状的预测能力和MSEP。在6个BF性状上，GMBLUP的平均预测能力在数值上高于GBLUP，绝对提高为0.023至0.084。GMBLUP下MSEP也在数值上较低，降低幅度为0.001至0.009。尽管预测能力的绝对提高幅度适中，但部分性状的相对提高较为可观。然而，这些差异在统计上不显著。因此，GMBLUP在本群体中表现出适度的数值增益，但未提供优于GBLUP的统计学显著改善。这些结果提示微生物组信息可能提供宿主基因组数据之外的补充预测信息，尽管在当前群体规模和预测框架下其对预测准确性的贡献有限。Christensen提出的GO-BLUP模型是为利用中间组学特征进行遗传评估而开发的，其中育种值分解为组学介导的育种值和残差育种值。该框架为将组学信息纳入遗传评估提供了更正式的方法。相比之下，本研究使用的GMBLUP模型将微生物关系矩阵拟合为额外随机效应，联合基因组和微生物组效应用于评估表型预测能力。因此，GMBLUP估计的微生物组效应不应直接解释为育种值，因为它可能同时包含宿主遗传控制和非遗传的微生物组变异。微生物组信息对遗传评估的贡献不仅取决于其与表型的关联，还取决于微生物组效应受宿主遗传控制的程度。尽管本研究中使用的动物为商业杂交猪而非核心育种群体个体，但本研究的主要目标是将宿主全基因组重测序数据与肠道宏基因组测序数据整合，以表征宿主-微生物组对脂肪沉积性状的贡献并评估微生物组辅助表型预测的可行性。猪肠道微生物群的组成并非静态，而是从出生到成年经历动态变化，在保育期达到相对稳定状态。本研究中，为最小化肠道微生物群组成的异质性，研究人员在标准化条件下饲养至约110 kg上市体重时采集粪便样本进行微生物组分析。仔猪早期肠道微生物群能否作为复杂宿主性状的可靠预测因子仍是未来研究的开放问题。此外，尽管宏基因组测序提供了微生物组分类组成和功能潜能的信息，本研究主要关注种水平微生物组组成。未来整合纵向微生物组采样与功能基因及分类图谱的研究可能提供对肠道微生物群与复杂经济性状之间生物学机制更全面的理解。

结论部分翻译如下：总之，在脂肪沉积表型对比的DLY猪之间，粪便微生物群落结构存在差异，鉴定出27个物种作为与脂肪沉积相关的潜在生物标志物。遗传力和微生物遗传力估计表明，脂肪沉积性状的变异与宿主基因组和肠道微生物组效应均相关，而基因组×微生物组互作仅解释可忽略比例的表型变异。GMBLUP相较于GBLUP的绝对改善幅度适中，6个脂肪沉积性状的预测能力小幅提高、预测误差略微降低。尽管GMBLUP一致显示数值上更高的预测能力，但这些差异在统计上不显著，表明在本群体中未提供优于GBLUP的统计学显著改善。尽管如此，数值增益提示肠道微生物组信息可能具有宿主基因组数据之外的补充预测价值，尽管在当前群体规模和预测框架下其预测贡献有限。