《Genome Biology》：G-quadruplex profiling using single-cell CUT&Tag offers insight into the epigenetic landscape of the developing mouse brain
编辑推荐：
背景：G-四链体（G-quadruplexes, G4s）是非经典DNA结构，因其在基因调控以及神经退行性疾病和癌症中的潜在作用而日益受到关注。尽管具有重要的生物学意义，但G4结构尚未在不同组织和细胞类型中得到系统性研究。
结果：在本研究中，研究人员采用G4单
背景：G-四链体（G-quadruplexes, G4s）是非经典DNA结构，因其在基因调控以及神经退行性疾病和癌症中的潜在作用而日益受到关注。尽管具有重要的生物学意义，但G4结构尚未在不同组织和细胞类型中得到系统性研究。
结果：在本研究中，研究人员采用G4单细胞CUT&Tag（G4 scCUT&Tag）技术，表征了出生后小鼠脑细胞中的G4景观，并利用了scRNA-Seq和scATAC-Seq数据集中常用的单细胞分析方法。通过使用常规的单细胞组学工作流程处理和分析数据，研究人员基于G4异质性区分出了不同的细胞谱系，并确定了一组谱系特异性基因具有独特的启动子G4。利用基于协方差的技术（典型相关分析）和基于迁移学习的方法进行的与scRNA-Seq基因表达谱的多组学整合，实现了更准确的细胞类型注释。这些整合不仅揭示了G4信号与基因表达之间的相关性，而且证明G4 scCUT&Tag能够详细检查复杂组织中的G4异质性，并支持将G4图谱与其他组学层进行整合分析，为理解发育中大脑的表观基因组景观提供了新的见解。
结论：研究人员的发现确立了G4 scCUT&Tag作为研究复杂组织中G4景观细胞异质性的框架，并为探索它们与基因调控及其他染色质组织层次之间的关系奠定了基础。
一、研究背景与研究目的
G-四链体（G-quadruplexes, G4s）是由富含鸟嘌呤的DNA或RNA形成的四链二级结构，其基本单元是G-四分体（G-tetrad）。G4在基因调控中扮演重要角色，例如在启动子区域可作为转录抑制的屏障，或在其他位点帮助维持开放染色质和基因活性。此外，G4还与基因组不稳定性、神经退行性疾病和癌症密切相关。尽管已有多种技术如G4-seq和G4 ChIP-seq用于G4的体外或群体细胞水平检测，但这些方法要么无法反映染色质环境和细胞类型特异性的调控，要么需要大量细胞（约107个）且信噪比较低。此前开发的G4 CUT&Tag技术虽已提高了灵敏度和降低了细胞需求，但尚未应用于原生异质性组织中进行单细胞分辨率的G4图谱绘制。因此，一个关键的科学问题是：G4能否在原生异质性组织中被稳健地检测，并且其折叠模式是否能反映细胞身份？本研究旨在开发并应用G4单细胞CUT&Tag（G4 scCUT&Tag）技术，对出生后第21天（P21）的小鼠脑细胞进行G4景观分析，并通过与单细胞转录组数据的整合来验证其在细胞分型和表观遗传学研究中的潜力。
二、主要关键技术方法
- 1.
G4单细胞CUT&Tag（G4 scCUT&Tag）： 研究人员开发了一种基于离心的高灵敏度变体，结合已有的基于液滴的10× Genomics scATAC试剂盒方案，利用BG4抗体进行原位标记和标签化，实现对单个细胞中内源性G4结构的全基因组定位。
- 2.
单细胞数据分析与降维聚类： 采用潜在语义索引（Latent Semantic Indexing, LSI）进行降维，并使用均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）进行可视化，随后通过共享最近邻（Shared Nearest Neighbors, SNN）算法（由Seurat包实现）进行无监督聚类。
- 3.
多组学数据整合： 使用两种策略将G4 scCUT&Tag数据与匹配的scRNA-seq数据进行整合：一是基于协方差的典型相关分析（Canonical Correlation Analysis, CCA），二是基于迁移学习的scBridge方法。后者通过渐进式学习，优先整合与scRNA-seq细胞谱最相似的G4细胞，从而实现更精确的细胞类型注释。
- 4.
顺式调控相互作用预测： 应用Cicero工具，基于单细胞G4信号的共现性，预测细胞类型特异性的顺式调控元件之间的相互作用网络。
三、主要研究结果
- •
scCUT&Tag图谱区分特定细胞群： 在小鼠胚胎干细胞（mESC）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）混合实验中，基于G4模式的聚类成功分离出两个对应细胞类型的簇。伪批量分析显示，各簇的G4信号与其对应的细胞系Bulk G4 CUT&Tag图谱高度相关（r ≈ 0.73-0.74），证实了方法的有效性。
- •
细胞类型特异性G4反映基因功能与调控： 谱系特异性G4峰富集在与相应细胞功能相关的基因本体论（GO）条目中（如MEF的细胞运动，mESC的发育形态发生）。值得注意的是，细胞类型特异性G4更多地出现在顺式调控元件而非启动子上，且其信号强度与染色质可及性（ATAC-seq信号）仅呈现弱相关性（Pearson r = 0.26–0.38），表明G4形成并非完全由开放染色质决定。
- •
出生后小鼠脑中G4景观独特于可及性： 在P21小鼠脑的GFP+细胞（主要包含胶质细胞谱系）中，虽然大部分G4峰与scATAC峰重叠（77%），但两者的信号相关性非常弱（Pearson r < 0.3），进一步支持G4的形成受独立于染色质可及性的机制调控。
- •
通过共嵌入与标签转移注释G4簇： 利用CCA将G4 scCUT&Tag数据与scRNA-seq参考数据集进行联合嵌入，成功将GFP+细胞群注释为星形胶质细胞（AST）、成熟少突胶质细胞（MOL）等主要细胞类型。特征图显示，G4信号在标记基因上的富集程度与其在scRNA-seq中的表达水平呈正相关。
- •
可靠性建模增强注释： 采用scBridge方法进行迁移学习，获得了更高的注释可靠性，其中2,083个细胞（总数2,767个）的可靠性评分超过0.9。基于此，研究人员聚焦于星形胶质细胞（AST）群体进行深入分析。
- •
星形胶质细胞特异性G4景观的特征： 通过差异分析，鉴定出18个具有AST特异性G4富集的基因和23个具有AST特异性启动子G4的基因。然而，只有少数基因（如Nwd1、Gli2）同时表现出AST特异性的高表达，而另一些基因（如Tmem74）虽有强启动子G4却未在AST中高表达，提示G4的形成可能独立于基因活性。对994个AST特异性G4峰的注释显示，89%位于已注释的调控区域内，包括远端增强子样特征（32%）和CTCF结合位点（25%）。
- •
G4共现网络揭示细胞类型特异性互作： 应用Cicero进行分析，在AST细胞中发现了22,928个相关性高于阈值的特征对，而在非AST细胞中仅有2,758个。这些共现连接大多发生在细胞类型特异性的G4峰之间，即使其间散布着组成型G4，暗示G4可能与细胞类型特异性的三维基因组组织有关。
四、讨论与结论
讨论总结： 本研究证明了G4 scCUT&Tag能够在原生异质性组织中实现单细胞分辨率的内源性G4景观分析。研究发现G4景观与染色质可及性既有联系又相互区别，两者信号仅弱相关，表明G4形成在很大程度上与可及性解耦。同样，虽然G4富集与转录活性整体正相关，但只有部分细胞类型特异性启动子G4与差异表达相对应，提示G4的形成不仅仅是基因活性的附带现象。细胞类型特异性G4频繁出现在推定的顺式调控元件中，并且Cicero分析识别出的相关G4位点与H3K27ac标记的调控元件重叠，支持G4参与细胞类型特异的染色质组织。当前的一个局限性是G4 scCUT&Tag在无监督条件下区分密切相关的细胞群体的能力弱于scRNA-seq或scATAC-seq，因此对异质性脑群体的注释受益于与参考转录组数据集的整合。
研究结论： 总之，本研究表明G4 scCUT&Tag能够在原生异质性组织中对内源性G4景观进行单细胞水平的分析。将该方法应用于出生后小鼠大脑，揭示了与细胞类型相关的G4异质性，并在胶质细胞和神经元群体中鉴定出独特的G4特征。与单细胞转录组数据的整合进一步实现了细胞类型注释，并揭示了细胞类型特异性G4富集与转录活性之间的关联。此外，鉴定出与推定顺式调控元件和预测的长程相互作用相关的G4位点，将G4 scCUT&Tag的应用从局部G4图谱扩展到了更广的层面。这些发现共同确立了G4 scCUT&Tag作为研究复杂组织中G4景观细胞异质性的框架，并为探索它们与基因调控及其他染色质组织层次之间的关系提供了基础。
