结构导向工程化 Fanzor 蛋白 SpuzFz1-v4.2 实现单次 AAV 体内高效低脱靶基因编辑

《Genome Biology》：Structure-guided engineering of eukaryotic Fanzor-ωRNA system enhances in vivo gene editing for dystrophin restoration in a Duchenne mouse model

　　

摘要

背景

真核Fanzor（Fz）蛋白是一类由RNA引导的紧凑型内切酶，与原核生物的TnpB/Cas12具有同源性，这为单次AAV（腺相关病毒）输送提供了理论上的优势。然而，由于其在哺乳动物中的编辑效率低下且特异性不明确，这些蛋白的应用在治疗方法开发中受到了限制。

结果

在本研究中，我们对Spizellomyces punctatus中的Fanzor1核酸酶（SpuFz1）进行了结构导向的工程改造，以提高其在体内基因编辑中的有效性，并鉴定出几种Fanzor变体，其编辑效率与广泛使用的微型酶enAsCas12f1和大型酶SpCas9相当或仅略低。我们证明了催化活性被灭活的dSpuFz1-v4.2可以用于CRISPRa介导的转录激活，这属于概念验证的范畴。在小鼠中进行的全基因组PEM-seq分析显示，该酶的转位频率非常低（低于0.05%，远低于PEM-seq协议设定的背景阈值），且未检测到任何脱靶编辑事件。GUIDE-seq分析也证实了SpuFz1-v4.2在人类细胞中的低脱靶效应，由于3’末端序列的适应性，仅有少量的脱靶编辑发生。通过胚胎mRNA注射可以高效生成突变小鼠。关键的是，在人源化的杜氏肌营养不良模型中，单次AAV9输送SpuFz1-v4.2能够实现目标外显子的跳跃缺失，使抗肌球蛋白的表达恢复到约野生型的10%，并改善了肌肉的收缩力。

结论

通过结构导向的优化，我们克服了真核Fanzor蛋白的活性障碍，同时保持了较低的脱靶效应。经过改造的SpuFz1-v4.2保留了适合单次AAV包装的超紧凑体积，为体内基因编辑提供了一个可靠的平台。这项初步的概念验证研究表明，Fanzor作为一种微型替代方案，有望成为CRISPR-Cas系统在遗传疾病干预和功能基因组学研究中的可行选择。

背景

真核Fanzor（Fz）蛋白是一类由RNA引导的紧凑型内切酶，与原核生物的TnpB/Cas12具有同源性，这为单次AAV输送提供了理论上的优势。然而，由于其在哺乳动物中的编辑效率低下且特异性不明确，这些蛋白的应用在治疗方法开发中受到了限制。

结果

在本研究中，我们对Spizellomyces punctatus中的Fanzor1核酸酶（SpuFz1）进行了结构导向的工程改造，以提高其在体内基因编辑中的有效性，并鉴定出几种Fanzor变体，其编辑效率与广泛使用的微型酶enAsCas12f1和大型酶SpCas9相当或仅略低。我们证明了催化活性被灭活的dSpuFz1-v4.2可以用于CRISPRa介导的转录激活，这属于概念验证的范畴。在小鼠中进行的全基因组PEM-seq分析显示，该酶的转位频率非常低（低于0.05%，远低于PEM-seq协议设定的背景阈值），且未检测到任何脱靶编辑事件。GUIDE-seq分析也证实了SpuFz1-v4.2在人类细胞中的低脱靶效应，由于3’末端序列的适应性，仅有少量的脱靶编辑发生。通过胚胎mRNA注射可以高效生成突变小鼠。关键的是，在人源化的杜氏肌营养不良模型中，单次AAV9输送SpuFz1-v4.2能够实现目标外显子的跳跃缺失，使抗肌球蛋白的表达恢复到约野生型的10%，并改善了肌肉的收缩力。

结论

通过结构导向的优化，我们克服了真核Fanzor蛋白的活性障碍，同时保持了较低的脱靶效应。经过改造的SpuFz1-v4.2保留了适合单次AAV包装的超紧凑体积，为体内基因编辑提供了一个可靠的平台。这项初步的概念验证研究表明，Fanzor作为一种微型替代方案，有望成为CRISPR-Cas系统在遗传疾病干预和功能基因组学研究中的可行选择。