《Advanced Biotechnology》：Advancing liquid biopsies in pediatric brain tumors: unlocking the clinical utility of circulating cell-free small RNAs
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组织标本仍是癌症诊断与分子表征的金标准，但其获取具有侵入性且常难以重复，这在儿童神经肿瘤学中尤为突出。液体活检为从可及生物体液中获取肿瘤相关信息提供了一种微创途径。血液（包括血浆与血清）是研究最广泛的基质，而脑脊液（CSF）在生物学上更接近中枢神经系统（CNS
组织标本仍是癌症诊断与分子表征的金标准，但其获取具有侵入性且常难以重复，这在儿童神经肿瘤学中尤为突出。液体活检为从可及生物体液中获取肿瘤相关信息提供了一种微创途径。血液（包括血浆与血清）是研究最广泛的基质，而脑脊液（CSF）在生物学上更接近中枢神经系统（CNS）肿瘤，可能提供更高的肿瘤来源信号。因此，通过液体活检进行分子谱分析在支持儿童脑肿瘤的精准医学、纵向疾病评估和治疗监测方面具有相当大的潜力。在循环调控RNA中，经典小RNA包括microRNA（miRNA）、PIWI相互作用RNA（piRNA）和tRNA衍生小RNA（tsRNA），而环状RNA（circRNA）代表一类结构和大小不同的RNA类别，也可在生物体液中检测到。目前儿童临床证据最强的是循环miRNA，多项研究支持其在若干儿童CNS肿瘤实体中的潜在诊断、预后、疾病监测和治疗反应评估应用。相比之下，循环piRNA和tsRNA主要仍由成人、混合年龄或临床前胶质瘤研究支持，需要在儿童队列中进行专门验证。当缺乏儿童数据时，成人来源的发现仍可作为产生假说的转化证据，但不应在未经独立儿童验证的情况下被视为可直接迁移。对循环RNA特征的解读还需考虑其生物学来源。循环RNA可能直接来源于肿瘤细胞，但也可能反映免疫和炎症反应、血细胞或血小板贡献、治疗效应以及血脑屏障或血肿瘤屏障通透性。因此，其在外周血中的检测不能简单归因于小分子尺寸，循环谱也可能无法忠实再现肿瘤RNA景观。临床转化进一步依赖于对分析前和分析变量的严格控制，包括生物体液选择、溶血、采集和处理程序、储存、RNA分离、归一化和平台选择。尽管small-RNA测序、RT-qPCR和digital PCR为发现和验证提供了互补机会，但儿童脑肿瘤中大多数循环RNA生物标志物仍处于研究阶段。在分子定义的儿童队列中进行前瞻性、多中心验证，标准化工作流程，证明分析性能和临床性能，以及独立的临床效用评估，是将这些生物标志物整合到常规患者管理之前必不可少的。
引言部分指出，生物标志物在神经肿瘤学的诊断、预后判断和治疗预测中至关重要。组织标本虽是肿瘤学诊断和揭示癌细胞生物学改变的金标准，但组织取样需要侵入性外科操作，可重复性有限且可能带来并发症。儿童患者因肿瘤位置和有限的手术空间，脑肿瘤的手术入路更具挑战性，可能增加神经外科操作的技术复杂性和并发症风险。因此，液体活检中的微创生物标志物（如循环小RNA）在该人群中可能特别有价值。此外，组织取样通常仅提供肿瘤的单一时空快照，而液体活检允许在治疗期间及疾病进展时追踪疾病进程。过去十年，尤其在小儿人群中，对诊断CNS肿瘤和监测其行为的替代方法的需求日益显现。其罕见性和分子异质性也限制了大型队列、独立验证数据集和前瞻性临床研究的可获得性。因此，当缺乏儿童患者特异性证据时，研究生物学相关的成人肿瘤可提供有价值的转化和假说生成信息。然而，儿童脑肿瘤不能被视为成人CNS肿瘤的年龄限制性对应物，因为它们在分子驱动因素、表观遗传景观、发育背景和临床行为上存在差异。此外，成人来源的发现需要独立的儿童验证。重要的是，儿童证据正在扩展，尤其是循环miRNA，尽管大多数研究仍规模较小、处于探索性阶段，需要前瞻性多中心验证。液体活检因其非侵入性和易获取性而成为有吸引力的材料来源。在各种生物体液中，血液（血浆和血清）仍是检测癌症生物标志物的主要介质，但尿液和CSF等其他样本也适用。尽管液体活检技术取得了显著进展，但大多数研究集中在成人型肿瘤，导致开发的定制面板常忽视儿童肿瘤的独特特征。值得注意的是，CNS肿瘤是儿童癌症相关死亡的主要原因，也是仅次于白血病的第二常见儿童癌症类型。通过液体活检进行肿瘤分子谱分析对推进精准医学和促进靶向治疗开发具有巨大前景。液体活检所用的生物体液含有循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、蛋白质、常规循环RNA和几类调控非编码RNA。其中，经典小RNA包括miRNA、piRNA和tRNA衍生片段，而circRNA代表一类结构和大小不同的RNA类别，也可在细胞外液和细胞外囊泡中检测到。这些组分已被证明可穿过血脑屏障（BBB），为脑肿瘤的微创监测提供了机会。循环肿瘤DNA（ctDNA）已被广泛研究，NGS面板等工具已进入临床实践。ctDNA和循环小RNA均可通过细胞死亡（包括凋亡和坏死）相关的被动释放以及涉及细胞外囊泡和其他细胞外载体的机制进入细胞外生物体液。循环小RNA可能提供与ctDNA互补的生物学信息，可能不仅反映肿瘤相关分子改变，还反映细胞活动、应激反应和肿瘤微环境相互作用的变化。然而，其循环水平也可能受非肿瘤来源和全身生理或病理状况的影响。与成人对应物相比，儿童癌症通常以较低的突变负荷和较少的复发性突变为特征，但表现出更大的表观遗传失调和更多的染色体畸变。表观基因组改变不仅包括甲基化，还包括小非编码RNA，如miRNA或piRNA。因此，小RNA代表了一个有前景的研究领域，有可能提供对CNS肿瘤生物学和疾病生物标志物的见解。循环miRNA是有吸引力的候选生物标志物，因为它们可以受保护的形式释放，包括细胞外囊泡（EV）、核糖核蛋白复合物和脂蛋白相关颗粒，这增加了它们在生物体液中的稳定性。CNS来源的细胞外RNA可在外周血中检测到；然而，其通过不应简单归因于其小分子尺寸。从CNS到体循环的运输可能取决于载体相关运输、主动内皮转胞吞、BBB和血肿瘤屏障（BTB）通透性变化以及CSF清除途径。这些机制的相对贡献仍未完全明确，并可能因肿瘤类型、解剖部位、疾病分期和BBB完整性而异。鉴于儿童CNS肿瘤对儿童癌症相关死亡率的影响，显然需要研究这些肿瘤的分子谱和体液中特定生物标志物的存在。鉴于讨论循环小RNA在儿童脑肿瘤中应用的综述数量有限，本综述旨在填补这一空白，全面总结与儿童脑肿瘤相关的循环小RNA生物标志物的现有研究，同时讨论为儿童患者开发液体活检生物标志物检测的技术挑战和潜在的未来进展。与主要关注成人脑肿瘤或单一RNA类别的现有综述不同，本综述特别关注儿童CNS肿瘤，将循环miRNA、piRNA和tRNA衍生小RNA（tsRNA）的证据整合在一个统一框架内，区分儿童临床证据与成人来源和临床前发现，同时考察其在精准肿瘤学中潜在实施的分析、临床验证和监管要求。
小RNA分泌途径部分指出，已确定三种主要的小RNA分泌途径：通过凋亡或坏死引起的细胞损伤的被动释放；由细胞外囊泡（包括外泌体和微囊泡）促进的主动分泌；涉及RNA结合蛋白和脂蛋白复合物的主动分泌。EVs包含脂质、蛋白质、mRNA和小RNA，但其在血浆或血清中的相对丰度强烈依赖于分析前和分离方法，且EV大小范围内的脂蛋白颗粒在血液中比EVs多至少一个数量级并与其共纯化，可能混淆EV相关小RNA谱。肿瘤细胞在exosome产生方面特别活跃。除小EVs和微囊泡外，凋亡小体也存在于生物体液中并可能携带RNA。由于EV亚型的大小范围重叠，仅凭大小无法将EV分配到特定的生物发生亚型，MISEV2023建议使用“小EVs”和“大EVs”等操作术语，除非亚细胞来源已证明。此外，小RNA可独立于囊泡释放：血浆中大部分无细胞miRNA并非囊泡相关，而是与含Ago2的核糖核蛋白复合物结合。其他非囊泡细胞外颗粒（包括exomeres和supermeres）以及脂蛋白也可能携带细胞外RNA。Ago2是RNA诱导沉默复合物（RISC）的一部分。高密度脂蛋白（HDL）已被确定为参与细胞间通讯和小RNA运输的另一个组分。关于儿童CNS肿瘤患者液体活检中发现的小RNA是否准确反映肿瘤本身的表达谱尚不确定。大多数在血清中检测到的与脑肿瘤存在强烈相关的miRNA变化并不对应于肿瘤组织中的miRNA表达水平，这表明这些外周miRNA改变可能来源于非肿瘤组织。至少四种非互斥过程可塑造CNS肿瘤患者的循环小RNA特征：直接来自肿瘤细胞的被动或主动释放；宿主全身和局部免疫反应的贡献；非特异性全身炎症和分析前处理（包括溶血和血小板活化）；治疗本身重塑循环小RNA池。区分这些不同来源的相对贡献对于正确解释循环小RNA特征的生物学和临床意义至关重要。BBB构成了CNS来源细胞外RNA与体循环之间的额外生物过滤器。自由循环的RNA分子不太可能仅因其小尺寸而穿过完整的BBB。相比之下，EV相关RNA可能通过脑内皮细胞的主动跨细胞运输。肿瘤相关屏障破坏在空间上是异质的，不能假定在整个CNS肿瘤中均匀发生。CSF介导的清除和淋巴引流可能提供CNS来源细胞外物质到达体循环的额外途径。
循环小RNA及相关环状RNA的生物学和临床作用部分，3.1 儿童脑肿瘤循环RNA生物标志物的转化证据指出，许多小RNA可在无细胞生物体液中检测到，并显示出与各种疾病状态相关的独特表达模式。目前儿童直接液体活检证据最强的是循环miRNA，包括在青少年毛细胞星形细胞瘤、儿童星形细胞瘤、DIPG、儿童胶质瘤、颅内恶性生殖细胞肿瘤、ETMR和髓母细胞瘤中的血清或血浆研究。其他循环RNA类别的直接儿童证据相当有限；值得注意的是，Lee等人在CSF中鉴定了髓母细胞瘤相关circRNA，而循环piRNA和tRNA衍生片段尚未在专门的儿童脑肿瘤队列中进行临床验证。相比之下，本综述纳入的几项研究来自成人或非儿童胶质瘤人群。成人来源和临床前发现作为假说生成而非临床验证证据时仍与儿童研究相关。3.2 MicroRNAs部分指出，miRNA是约22个核苷酸长的小非编码RNA分子，主要通过基因沉默调控基因表达。miRNA引导Argonaute蛋白至靶mRNA的3‘非翻译区（UTR），抑制翻译并促进mRNA降解。单个miRNA可调控多个基因。miRNA失调通过靶向癌基因或抑癌基因深度参与肿瘤发生和癌症进展。自2008年以来，越来越多的证据表明内源性循环miRNA（ct-miRNA）存在于各种生物体液中，包括血液（血清和血浆）、唾液、尿液、CSF和泪液。它们对內源性RNase活性表现出高度稳定性，因为它们被细胞外囊泡封装、与含Ago2的核糖核蛋白复合物结合或与高密度脂蛋白结合所保护。Bookland等人是探索ct-miRNA在儿童脑肿瘤中诊断潜力的先驱，在青少年毛细胞星形细胞瘤患者中鉴定了一个由四种ct-miRNA（miR-21、miR-15b、miR-23a和miR-146b）组成的特征，其表达水平能够预测肿瘤结节大小和治疗反应，达到86%的灵敏度和100%的特异性。一个三ct-miRNA血清特征（miR-130a、miR-145和miR-335）被证明是特异性生物标志物。Iannó等人在2022年鉴定了一个与DIPG儿童患者疾病进展相关的循环13-miRNA预后特征。该特征在训练队列（n=23）中开发，随后在单独的验证队列（n=24）中评估。在验证队列中，该特征显著分层患者的无进展生存期（PFS；HR=5.51，95% CI：2.03–14.9；log-rank p=0.00026）。该特征还与总生存期相关（HR=4.12，95% CI：1.57–10.8；log-rank p=0.0021）。Rogachevsky等人在68名儿童胶质瘤患者和12名健康对照的血浆样本中评估了一个五-miRNA特征，证明所有五个循环miRNA在儿童胶质瘤患者中显著上调。在CNS肿瘤中，生殖细胞肿瘤（GCTs）以表观基因组失调为特征。目前使用的生物标志物AFP和HCG在诊断恶性GCTs方面灵敏度和特异性有限。来自miR-371~373和miR-302/367簇的循环miRNA在恶性GCTs中持续过表达，miR-371a-3p在诊断时血清和CSF中水平显著升高。Madlener等人在ETMR儿童患者的液体活检研究中提出miR-517a作为ETMR的诊断标志物，其ROC曲线在血液样本中显示AUC约为1，并提出miR-517a作为疾病监测的生物标志物。Xue等人发现髓母细胞瘤患者血浆exosome中miR-101-3p和miR-423-5p水平显著高于健康对照，体外功能分析显示这两种miRNA通过直接靶向FOXP4基因作为肿瘤 suppressor 发挥作用。3.3 PIWI相互作用RNA（piRNAs）部分指出，piRNA是通常24–31个核苷酸长的小非编码RNA，与PIWI家族蛋白结合，最著名的功能是转座元件沉默和基因组稳定性维持。在儿童脑肿瘤中的证据仍然极其有限。我们的更新文献检索未鉴定出专门的儿童髓母细胞瘤、室管膜瘤、DMG/DIPG或儿童高级别胶质瘤队列，其中循环piRNA被临床验证为诊断、预后或监测生物标志物。现有临床证据主要来自成人或混合年龄胶质瘤人群。Hallal等人鉴定了几个差异表达的piRNA注释序列，包括piR_016658、piR_016659、piR_020829和piR_020490。Huang等人在CSF和血浆中进行了全面的无细胞RNA谱分析，并在胶质瘤相关CSF特征中鉴定了piR-28347，但该研究仅纳入18名11–72岁（平均44岁）的胶质瘤患者，未进行儿童特异性分析。这些发现应被视为成人来源或混合年龄的概念验证证据，而非儿童脑肿瘤的直接证据。此外，将small-RNA测序读数分配给piRNA时需要特别谨慎。3.4 tRNA衍生小RNA部分指出，tRNA可生成受调控的小RNA物种，统称为tRNA衍生小RNA（tsRNAs），包括tRNA衍生片段（tRFs）和tRNA半分子。然而，目前缺乏儿童脑肿瘤中循环tsRNAs的直接临床证据。胶质瘤中的当前证据主要来自成人肿瘤数据集、实验模型或主要为成人的临床队列。Wei等人通过分析TCGA LGG/GBM数据鉴定了tRF-19-R118LOJX和tRF-19-6SM83OJX，随后在人类胶质瘤细胞系中进行了研究。两种tRF均抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和血管生成拟态，其中tRF-19-R118LOJX至少部分通过负调控S100A11发挥作用。3.5 从已建立的miRNA证据到新兴的piRNA和tsRNA生物标志物部分指出，缺乏儿童piRNA和tsRNA研究与循环miRNA更广泛和更成熟的儿童证据形成对比。几项因素可能解释文献中的这种不平衡。miRNA受益于更长的生物学和方法学研究时期，自2008年 seminal 报道证明其在血清和血浆中的稳定性和可检测性以来，循环miRNA一直作为癌症生物标志物进行研究。相比之下，哺乳动物piRNA发现较晚，其在体细胞组织、癌症和细胞外生物体液中的研究发展较近。tsRNAs面临相关但不同的挑战。它们包含通过多种切割机制生成的异质性tRNA衍生片段组，其命名尚未完全标准化。因此，当前儿童患者液体活检中小RNA的证据仍主要以miRNA为基础，而piRNA和tsRNA代表有前景但仍 largely 未探索的类别，需要专门的前瞻性儿童研究。
环状RNA作为新兴液体活检生物标志物部分指出，circRNA是主要通过反向剪接生成的共价闭合RNA分子。虽然它们不被严格归类为小RNA，因为它们中许多超过200个核苷酸长度，但它们在液体活检研究中常与循环小RNA一起分析，并正在成为有前景的生物标志物。常规small-RNA测序不应被视为circRNA检测或定量的标准方法。可靠的circRNA谱分析通常需要专门的RNA测序策略、适当的文库构建和大小选择以及反向剪接连接点的生物信息学鉴定。其闭合结构赋予对核酸外切酶介导降解的抗性，增加了其在生物体液中的稳定性。儿童脑肿瘤中循环circRNA的液体活检证据开始出现，主要来自CSF。Lee等人对40名髓母细胞瘤儿童和11名对照的CSF进行了谱分析，鉴定出circ_463和circ_273作为候选生物标志物，可将患者与对照区分开来。
循环小RNA检测在血液和CSF中的技术和分析前挑战部分，5.1 生物体液选择指出，生物体液的选择是研究间变异的主要来源，应根据预期的临床应用来确定。血浆和血清不能被视为分析上可互换的。在血清制备过程中，凝血和血小板活化可改变细胞外RNA池，而血浆可根据采集和离心程序保留不同数量的血小板、白细胞、细胞碎片和血小板衍生细胞外囊泡。因此，前瞻性生物标志物研究应在发现和验证全程使用单一预定义基质。对于循环无细胞RNA分析，血小板耗尽血浆具有吸引力，因为它减少了残留细胞物质的贡献。CSF在生物学上更接近CNS肿瘤，可能提供更有利的肿瘤来源信号与背景比，但其在儿童患者中的使用受到侵入性、可用体积低和腰椎穿刺时常需镇静的限制。重要的是，从有限的儿童CSF体积中进行分子谱分析的可行性已被证明。5.2 血液采集、溶血、处理、离心和储存部分指出，分析前标准化应从静脉穿刺开始。应记录每个标本的采集管类型、抗凝剂、从采血到处理的时间、运输条件、离心和样本储存。肝素对基于PCR的RNA检测尤其成问题，因为它抑制逆转录酶和DNA聚合酶。处理延迟是另一个主要混杂因素。溶血尤其关键，因为红细胞含有丰富的miRNA，即使视觉上轻微的溶血也能显著改变循环miRNA测量。应客观评估溶血，例如通过分光光度法测量游离血红蛋白和/或基于miRNA的指标如miR-451a/miR-23a关系。5.3 RNA分离、质量控制和归一化部分指出，RNA分离是系统变异的额外来源。低浓度生物体液通常含有低于常规分光光度法可靠范围的RNA，而提取效率因苯酚基、柱基和联合方案而异。外源性合成RNA在提取前加入可用于监测提取效率，外源性spike-ins应主要被视为技术过程控制，不应自动用作生物学归一化因子。目前没有普遍稳定的内源性循环miRNA适用于所有生物体液、疾病和实验条件。对于RT-qPCR研究，候选内源性参考miRNA应在相关基质和队列中经验性验证。5.4 分析平台部分指出，没有单一分析平台对所有阶段的循环小RNA生物标志物开发都是最佳的。Small-RNA测序特别适合发现，因为它能够同时 interrogate 数百至数千个已知和潜在新型小RNA。RT-qPCR仍然是靶向验证的高度合适方法，因为它灵敏、相对便宜、广泛可用，并可从有限RNA输入中定量小面板。Digital PCR，特别是微滴数字PCR（ddPCR），对于低丰度候选生物标志物具有吸引力，因为样本分区允许无需外部校准曲线直接绝对定量，并在低靶拷贝数下提供高精度。对于儿童神经肿瘤学，一个务实的工作流程是在有足够材料时使用small-RNA测序进行发现，随后在更大的独立队列中使用RT-qPCR或ddPCR对限制性候选面板进行正交验证。5.5 提高外周血中CNS来源小RNA的灵敏度部分指出，外周血带来的分析挑战不仅仅是检测灵敏度的问题。CNS来源分子进入体循环后在生物学上被稀释，并与血液和外周组织释放的更大池的小RNA共存。因此，仅提高分析灵敏度无法弥补较差的肿瘤特异性。策略应旨在提高分析灵敏度和肿瘤与背景比。候选血液生物标志物应优先不仅选择高分析可检测性，还应选择CNS/肿瘤富集的证据。
从机制可操作性到儿童脑肿瘤RNA生物标志物的临床验证部分指出，机制研究表明非编码RNA的生物学功能可能揭示治疗可操作的脆弱性，尽管通路可操作性与相应循环生物标志物的临床验证应明确区分。在胶质母细胞瘤模型中，PIWIL1是胶质瘤干细胞维持和致瘤性所必需的，其沉默可减少肿瘤生长并延长体内生存。PUS7依赖性tRNA假尿苷化支持胶质母细胞瘤干细胞致瘤性，而实验性小分子PUS7抑制剂可减少假尿苷化、抑制肿瘤发生并延长临床前模型中的生存。髓母细胞瘤中，miR-520h/CDK6和miR-383-5p/FOXM1轴及其在液体活检中的表达受circSKA3调控，将非编码RNA电路与治疗可操作的细胞周期通路联系起来。与这些机制进展相比，儿童神经肿瘤学中循环小RNA生物标志物的前瞻性临床验证仍然有限。最直接相关的注册研究主要是观察性生物标志物研究，没有一项使用循环小RNA结果来分配治疗或选择患者进行特定抗癌治疗。这一差距具有重要的监管意义。将循环小RNA特征转化为临床实践需要明确定义的预期用途、严格控制的预分析变异性、测量方法的分析验证、可重复的决策阈值以及独立前瞻性证明临床性能和临床效用。FDA生物标志物资格认证计划特别要求生物标志物在明确定义的预期用途内得到支持，并考虑分析性能、测量变异来源以及生物标志物与临床结局和治疗之间的关系（如适用）。在欧洲，欧盟体外诊断医疗器械法规（IVDR）要求证明科学有效性、分析性能和临床性能。最后，如果循环小RNA检测用于识别预期从特定治疗中获益的患者，它可能符合IVDR下伴随诊断的定义。
结论部分指出，需要一类新型生物标志物来监测儿童CNS肿瘤的疾病进展和治疗反应。特别是由于肿瘤位置，迫切需要侵入性更小、风险更低的技术。循环小RNA代表一个有前景的机会，尤其是近年来，其在CSF和血液中的检测在诊断和疾病监测方面引起了显著关注。由于循环小RNA是表观遗传调控因子，其表达可能快速变化；因此，一个重要讨论点是需要就采集时间点、样本类型和样本处理技术达成共识。然而，尽管最初有前景，大多数这些标志物尚未超越早期发现阶段。将这些生物标志物转化为临床实践的一个关键挑战是研究之间的不一致性和缺乏可重复性，通常由于样本制备、分析方法或所用技术的差异。为向前推进，解决这些技术问题并标准化程序至关重要。生物标志物开发应使用前瞻性定义和标准化的程序进行生物体液选择、采集、处理、溶血和血小板评估、储存、RNA分离、归一化和分析验证。Small-RNA测序、RT-qPCR和digital PCR之间的选择应由生物标志物开发的预期阶段和可用样本体积驱动，尽可能跨平台进行正交验证。这些要求在儿童神经肿瘤学中尤为重要，因为有限的血液和CSF体积放大了分析前变异性，且外周血中CNS来源信号可能被非肿瘤RNA强烈稀释。因此，协调的多中心方案和在分子定义的儿童队列中的前瞻性验证是将有前景的循环小RNA特征转化为临床可重复检测的先决条件。展望未来，CNS肿瘤的非侵入性分子谱分析有潜力成为常规临床护理的一部分，通过实现更安全、非侵入性诊断、最小化手术风险和促进肿瘤出现和进展的早期检测来革新患者管理。总之，循环小RNA临床采用的的最低要求的实用路线图如下：预定义预期用途；标准化分析前工作流程；检测的分析验证；预定义决策阈值；在儿童队列中进行前瞻性、多中心临床验证；证明临床效用。
