基于DIA蛋白质组学与在体验证的通痹清消方治疗痛风性关节炎（gouty arthritis, GA）机制研究：JAK2/STAT3信号通路与巨噬细胞极化的相关性

《Frontiers in Immunology》：Mechanism of Tongfeng Qingxiao Prescription in treating gouty arthritis: a correlation study of the JAK2/STAT3 signaling pathway and macrophage polarization

研究目的：全球痛风性关节炎（gouty arthritis, GA）的发病率持续上升，传统西医治疗存在一定局限性；中药复方通痹清消方（Tongfeng Qingxiao Prescription, TFQXP）已取得确切的临床疗效。本研究旨在探索TFQXP治疗GA的潜在分子关联。

研究方法：研究人员建立单钠尿酸盐（monosodium urate, MSU）诱导的GA大鼠模型，应用数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）蛋白质组学筛选核心差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）及富集的信号通路；随后在体实验采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、逆转录实时定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）、免疫荧光及免疫组织化学方法检测多种炎症介质，包括γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、白细胞介素-12（interleukin-12, IL-12）、白细胞介素-23（interleukin-23, IL-23）、一氧化氮（nitric oxide, NO）和白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10），以及巨噬细胞极化（macrophage polarization）和JAK₂/STAT₃信号通路相关指标。

研究结果：四个组共鉴定出1852种共有蛋白。模型组与空白组间筛选出112个差异表达蛋白，TFQXP高剂量组与模型组间筛选出170个。功能富集分析显示，核心差异蛋白显著富集于JAK-STAT（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，Janus激酶/信号转导与转录激活因子）信号通路、免疫炎症及脂质代谢相关通路。TFQXP显著减轻GA大鼠的踝关节肿胀并缓解滑膜病理损伤；下调血清中IFN-γ、iNOS、IL-12、IL-23和NO等促炎因子的水平，同时上调抗炎因子IL-10。此外，TFQXP处理伴随M₁相关标志物表达降低和M₂相关标志物表达增加，表明巨噬细胞极化向M₂样表型偏移。同时，JAK₂和STAT₃的蛋白及磷酸化水平降低，细胞因子信号抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1, SOCS-1）表达升高。

研究结论：TFQXP对GA的治疗作用可能与JAK₂/STAT₃信号通路的改变及M₁/M₂巨噬细胞极化平衡的恢复相关，有助于缓解关节炎症。研究人员将进一步通过靶向通路干预实验验证JAK₂/STAT₃信号调控巨噬细胞极化的因果关系。

【研究背景与意义】

痛风性关节炎（gouty arthritis, GA）是由单钠尿酸盐（monosodium urate, MSU）晶体沉积引起的代谢性晶体相关性关节病。过去二十年间全球GA发病率上升63.44%，2023年我国痛风患病率达1%~3%，已成为继糖尿病之后第二大常见代谢性疾病；急性发作以剧烈疼痛和持续性炎症为特征，可进展为关节破坏与肾损害。现有常规治疗以抗炎药和降尿酸药为主，但存在频繁复发、长期用药不良反应及患者依从性差等局限。中医将GA归于“痹风”“痹证”范畴，以湿热证型最为常见。通痹清消方（Tongfeng Qingxiao Prescription, TFQXP）由全国著名中医风湿专家邓运明（Deng Yunming）教授基于数十年临床经验创制，按君、臣、佐、使配伍发挥健脾、清热、利湿、通络、止痛之效；既往研究证实其可抑制NLRP₃炎症小体、调控PI3K/Akt（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B）通路、抑制NF-κB（nuclear factor-kappa B，核因子-κB）通路并经抑制黄嘌呤氧化酶促进尿酸排泄。基于上述背景，研究人员采用蛋白质组学提出机制假设并进行在体验证，以阐明TFQXP抗GA的分子机制。

【关键技术与方法】

主要关键技术方法包括：血清DIA（data-independent acquisition，数据非依赖采集）蛋白质组学定量分析，结合GO（Gene Ontology，基因本体论）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）、Reactome功能富集及PPI（protein-protein interaction，蛋白质-蛋白质相互作用）网络分析筛选核心差异蛋白与通路。样本队列采用MSU晶体关节腔注射联合高糖高脂饮食建立GA大鼠模型；验证实验用84只6周龄SPF级SD（Sprague-Dawley，斯普拉格-道利）大鼠，分设空白、模型、TFQXP低/中/高剂量及双氯芬酸组（n=10）；蛋白质组学分析用24只大鼠（n=6），分设空白、模型、TFQXP高剂量及双氯芬酸组。在体验证采用HE（hematoxylin-eosin，苏木精-伊红）染色、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验）、Western blot（蛋白质免疫印迹）、RT-qPCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，逆转录实时定量聚合酶链反应）、免疫荧光及免疫组织化学技术。

【研究结果】

3.1 蛋白质组学分析

3.1.1 数据质量质控：多数蛋白由不少于两条独特肽段匹配，肽段长度多分布于8~20个氨基酸，seqKNN插补法NRMSE较低，数据质量高、可靠，满足后续分析要求。

3.1.2 全局蛋白数据分析：四个组分别鉴定1910、1912、1923、1925种蛋白，1852种为共有蛋白；PCA（principal component analysis，主成分分析）与PLS-DA（partial least squares-discriminant analysis，偏最小二乘判别分析）显示各组样本明显分离，TFQXP组最接近空白组且模型未过拟合，提示TFQXP可使异常蛋白谱恢复至接近正常生理状态。

3.1.3 差异蛋白分析：模型组与空白组间筛选出112个差异表达蛋白（DEPs，43个上调、69个下调），TFQXP高剂量组与模型组间筛选出170个DEPs（119个上调、51个下调），两组比较存在64个重叠DEPs，作为TFQXP逆转GA病理状态的核心蛋白集。

3.1.4 功能富集分析：GO富集显示核心差异蛋白定位于线粒体等细胞器，参与脂肪酸代谢、β-氧化及花生四烯酸与前列腺素生成等；KEGG富集显示其显著富集于JAK-STAT（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，Janus激酶/信号转导与转录激活因子）、IL-17、TNF等免疫炎症通路及PPAR等代谢与自噬、凋亡等细胞命运通路；Reactome富集显示涉及免疫调节、基础代谢与氧化应激等；PPI网络分析鉴定出NDUFV1、Casp3、Acadm等枢纽蛋白。鉴于JAK-STAT通路在免疫炎症条目中富集最显著，且JAK₂/STAT₃是调控巨噬细胞极化的经典上游信号轴，研究人员据此提出假设并进行在体验证。

3.2 动物实验验证

3.2.1 一般观察及踝关节肿胀指数：除空白组外各组大鼠均出现精神萎靡、跛行及右踝红肿热痛等典型GA表现；各给药组（低剂量组除外）踝肿胀指数较模型组下降，中、高剂量组与双氯芬酸组无显著差异，低剂量组高于双氯芬酸组。

3.2.2 滑膜组织病理学变化：HE染色显示模型组滑膜细胞增生、广泛炎性浸润及新生血管增多，各药物干预组病变均减轻，以双氯芬酸组及中、高剂量组改善更明显。

3.2.3 血清炎症因子检测：模型组IFN-γ、iNOS、IL-12、IL-23、NO升高而IL-10降低；中、高剂量TFQXP组显著降低促炎因子并升高IL-10，与双氯芬酸组无显著差异；低剂量组各项炎症指标均差于双氯芬酸组，提示抗炎效应呈剂量依赖性。

3.2.4 Western blot检测巨噬细胞表型标志物：模型组M2标志物Arg1、CD206蛋白降低，M1标志物iNOS、CD86蛋白升高；各给药组iNOS、CD86降低、Arg1升高，中、高剂量组CD206升高，与双氯芬酸组无显著差异，低剂量组则相反。

3.2.5 RT-qPCR检测巨噬细胞特征因子基因表达：与蛋白结果一致，各给药组Arg1、CD206 mRNA不同程度上调（低剂量组Arg1无显著差异），iNOS、CD86 mRNA均降低；中、高剂量组与双氯芬酸组无显著差异，低剂量组iNOS、CD86升高。

3.2.6 免疫荧光检测巨噬细胞极化：CD68在各组间无显著差异，提示滑膜巨噬细胞总数无明显变化；与模型组相比各给药组CD206上调、CD86下调，表明TFQXP促巨噬细胞极化向M₂样表型偏移。

3.2.7 Western blot检测JAK/STAT通路相关蛋白：模型组JAK₂、STAT₃、p-JAK₂、p-STAT₃升高而细胞因子信号抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1, SOCS-1）降低；各给药组四种蛋白不同程度降低（低剂量组p-JAK₂、p-STAT₃无显著差异），SOCS-1在双氯芬酸组及中、高剂量组升高，提示TFQXP抑制JAK₂/STAT₃通路过度激活。

3.2.8 RT-qPCR检测JAK₂、STAT₃、SOCS-1基因表达：模型组JAK₂、STAT₃ mRNA升高而SOCS-1 mRNA降低；各给药组JAK₂、STAT₃ mRNA降低，SOCS-1 mRNA除低剂量组外均升高；中、高剂量组与双氯芬酸组无显著差异，低剂量组JAK₂、STAT₃ mRNA升高。

3.2.9 免疫组织化学检测JAK₂、STAT₃、p-JAK₂、p-STAT₃蛋白表达：模型组四种蛋白阳性表达率与平均光密度（MOD）均升高；各给药组均降低，中剂量组与双氯芬酸组无显著差异；高剂量组p-JAK₂表达升高，低剂量组JAK₂、STAT₃、p-JAK₂升高。

【讨论与结论】

讨论部分指出，GA的核心病理特征为炎症因子持续升高导致“免疫应激”状态。既往研究表明MSU可诱导巨噬细胞炎症极化：M₁型（CD86⁺）由IFN-γ诱导并分泌促炎因子，其极化程度反映炎症水平；M₂型（CD206⁺）由IL-10激活发挥抗炎作用，GA急性发作时巨噬细胞先向M₁极化、后期向M₂极化，这是急性GA炎症自行消退的关键。本研究蛋白质组学结果与之一致，核心差异蛋白参与线粒体功能、脂质代谢与炎症反应；JAK₂/STAT₃是驱动M₁极化的关键通路，其过度激活限制M₂极化，故经该通路调控巨噬细胞极化是缓解GA炎症、恢复免疫稳态的重要环节。在体结果证实TFQXP可减轻踝肿胀与滑膜损伤、下调促炎因子并上调IL-10、重塑M₁/M₂平衡、降低JAK₂/STAT₃活性并升高SOCS-1，呈现JAK₂/STAT₃信号与巨噬细胞极化改变的平行相关变化。

研究结论：TFQXP可逆转GA大鼠异常蛋白表达谱，核心差异蛋白富集于免疫炎症、代谢及细胞命运调控相关通路，其中JAK₂/STAT₃信号通路富集最为显著；在体实验证实TFQXP有效减轻MSU诱导GA大鼠的踝肿胀与滑膜病理损伤，下调JAK₂/STAT₃及其磷酸化蛋白并升高SOCS-1，诱导巨噬细胞向M₂样表型偏移、恢复促/抗炎因子平衡。但JAK₂/STAT₃信号改变是上游触发因素还是巨噬细胞表型重塑的继发结果尚无法区分，未来需通过通路特异性功能拯救实验验证因果关系。本研究为TFQXP治疗GA提供了有价值的关联分子证据与参考。