《Frontiers in Neurology》：Integrative transcriptomic and network pharmacology analyses explore potential mechanisms underlying the protective effects of Mailuoning oral liquid after intracerebral hemorrhage in mice
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背景：由神经炎症和血脑屏障（BBB）破坏驱动的继发性脑损伤是导致脑出血（ICH）后预后不良的重要因素。买乐宁口服液（MLN）具有抗炎和血管保护活性；然而，其在ICH中的保护作用及机制尚不清楚。目的：评价MLN对ICH后的保护作用并探讨其潜在机制。方法：在C57
背景：由神经炎症和血脑屏障（BBB）破坏驱动的继发性脑损伤是导致脑出血（ICH）后预后不良的重要因素。买乐宁口服液（MLN）具有抗炎和血管保护活性；然而，其在ICH中的保护作用及机制尚不清楚。目的：评价MLN对ICH后的保护作用并探讨其潜在机制。方法：在C57BL/6J小鼠中建立胶原酶诱导的ICH模型。评估神经功能缺损、脑损伤、脑水肿、BBB功能障碍及BBB相关蛋白。整合转录组学和网络药理学以识别候选靶点和通路，随后进行蛋白水平验证及佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）干预。结果：MLN改善神经功能，减轻血肿周围损伤和早期血肿负荷，减少脑水肿和BBB渗漏，增加claudin-5、occludin和ZO-1表达，降低MMP-9表达。转录组学鉴定出383个MLN响应基因，主要富集于炎症和免疫通路，包括NF-κB信号通路。网络药理学独立鉴定出114个MLN–ICH靶点，同样突出炎症相关通路。整合分析获得95个MLN逆转的ICH响应基因及三个交叉支持的候选基因：F10、Ccl2和Tnf。MLN降低总NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达，而PMA联合处理部分减弱了MLN相关的神经功能和BBB相关蛋白表达的改善。结论：MLN减轻ICH后继发性脑损伤并维持BBB完整性。这些保护作用可能与调控NF-κB相关炎症反应及MMP-9相关的BBB改变有关。
脑出血（ICH）是一种严重的脑血管疾病，具有高死亡率和长期致残率。除血肿形成所致的原发性机械损伤外，血液成分及其降解产物可启动涉及神经炎症、氧化应激、细胞毒性损伤、血脑屏障（BBB）破坏及脑水肿的继发性脑损伤。神经炎症与BBB功能障碍在此过程中密切关联：resident及浸润性免疫细胞的激活和促炎介质的释放可损伤脑微血管内皮、破坏细胞间连接并增加基质降解蛋白酶的表达，从而提高BBB通透性，促进血管源性水肿和神经功能恶化。目前ICH的临床管理主要集中于血压控制、抗凝逆转或凝血障碍纠正、适当选择患者的血肿管理及综合支持治疗，然而针对继发性脑损伤、特别是炎症相关BBB功能障碍的有效药物干预仍然有限。传统中医药（TCM）及其活性成分已被研究作为ICH后继发性脑损伤的潜在干预手段。临床证据提示活血化瘀疗法可能对颅内出血具有治疗益处，而中药来源化合物和制剂的实验研究已证实其对ICH后脑水肿、BBB完整性、神经功能障碍和氧化应激具有作用。买乐宁口服液（MLN）是一种多味中药组成的复方制剂，传统用于清热、养阴、促进血液循环和化瘀。既往药理学研究报告MLN在血管损伤、内皮功能障碍和脑缺血模型中具有抗炎、内皮及血管保护和神经保护作用。化学表征和药代动力学研究进一步鉴定了多种MLN相关成分，包括若干具有可观全身暴露的化合物。鉴于ICH后神经炎症与BBB破坏之间的密切相互作用，MLN兼具抗炎和血管保护特性为研究其是否能减轻这一耦联病理过程提供了特定的药理学依据。然而，MLN改善ICH后继发性脑损伤和BBB功能障碍的直接证据仍然有限，其体内分子反应及可能相关的调控网络尚未被系统表征。因此，确定MLN既往 reported的药理学特性是否能转化为对ICH相关神经血管损伤的保护作用，对于确立其在该疾病背景下的治疗相关性具有重要意义。为填补这一未解决的空白，需要一种能够同时捕捉MLN在ICH脑组织中诱导的分子反应以及多组分制剂相关的更广泛药物–疾病靶点格局的方法。转录组分析提供了治疗相关基因表达变化的体内读数，而网络药理学提供了一种互补的、以药物为导向的方法，基于化学成分、分子靶点和疾病相关基因之间的关系预测潜在靶点和通路。因此，比较这两个层次的证据可能有助于识别汇聚的分子过程，并优先确定具有生物学相关性的靶点和通路以进一步研究。在本研究中，研究人员旨在确定MLN是否改善ICH相关继发性脑损伤和BBB功能障碍，并探讨这些效应背后的分子过程。表型评估与体内转录组分析和独立进行的网络药理学相结合，以识别汇聚的炎症和BBB相关靶点及通路，并通过蛋白水平分析和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）干预进一步验证。这种整合方法旨在识别与MLN在ICH后保护作用相关的潜在炎症相关机制，并为进一步机制研究提供基础。
研究人员开展了以下研究：在C57BL/6J小鼠中建立胶原酶诱导的ICH模型，评估MLN（9.1 mL/kg和18.2 mL/kg）对神经功能缺损、脑损伤、脑水肿、BBB功能障碍及BBB相关蛋白的影响。通过转录组测序（RNA-seq）分析ICH和MLN处理后的基因表达变化，并结合网络药理学（基于TCMSP、ETCM等数据库筛选MLN活性成分及靶点，与ICH疾病靶点取交集）识别候选靶点和通路。随后进行蛋白水平验证（Western blot和免疫荧光）及PMA药理干预实验。此外，还进行了BV2小胶质细胞的体外实验以验证MLN含药血清的抗炎作用。研究得出以下结论：MLN改善ICH后神经功能，减轻血肿周围组织损伤和早期血肿负荷，减少脑水肿和BBB渗漏，增加紧密连接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1表达，降低MMP-9表达。转录组学和网络药理学整合分析汇聚于炎症相关通路，特别是NF-κB信号通路，并鉴定出F10、Ccl2和Tnf三个交叉支持的候选基因。MLN降低NF-κB p65及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达，而PMA联合处理部分逆转了MLN的保护作用。这些发现表明MLN可能通过调控NF-κB相关炎症反应和MMP-9相关的BBB改变来减轻ICH后继发性脑损伤，为MLN作为ICH潜在多靶点治疗策略的进一步临床前研究提供了实验证据。
主要关键技术方法：研究采用胶原酶诱导的小鼠ICH模型（C57BL/6J雄性小鼠，8–10周龄，20–24 g，购自华创信诺生物科技有限公司）；通过口服灌胃给予MLN（9.1 mL/kg和18.2 mL/kg），每日一次连续5天；采用mNSS、NDS、转角实验和前肢握力实验评估神经功能；通过H&E染色、Nissl染色、MRI（7.0-T小动物MRI系统）评估脑组织损伤和血肿体积；采用干湿重法测定脑含水量、Evans蓝渗漏实验评估BBB通透性；通过Western blot和免疫荧光检测BBB相关蛋白及炎症因子表达；对ICH后第5天同侧纹状体组织进行转录组测序（Illumina NovaSeq 6000平台，PE150）及差异表达分析（DESeq，阈值|log2FoldChange|>1且P<0.05）；网络药理学分析基于TCMSP和ETCM数据库筛选MLN活性成分（OB≥30%，DL≥0.18），从MalaCards、DisGeNET、GeneCards、OMIM和DrugBank数据库获取ICH疾病靶点，通过STRING构建PPI网络并用Cytoscape进行拓扑分析；采用Metascape进行GO和KEGG富集分析；通过BV2小胶质细胞体外实验（hemin刺激，CCK-8和ELISA）验证抗炎效果；通过侧脑室注射PMA（480 pmol/只）进行药理干预实验。
研究结果：（1）MLN改善ICH后神经功能——通过mNSS、NDS、转角实验和前肢握力实验评估，发现低剂量MLN（9.1 mL/kg）在多个行为学终点上表现出更一致的改善效果，因此选用于后续实验。（2）MLN减轻组织病理学损伤、血肿负荷、BBB通透性和脑水肿——通过H&E和Nissl染色显示MLN减轻血肿周围组织结构紊乱和神经元损伤，增加Nissl阳性神经元数量；MRI显示MLN组第3天和第5天血肿体积显著减小；Evans蓝渗漏和脑含水量测定显示MLN显著降低BBB通透性和脑水肿。（3）MLN增加BBB紧密连接蛋白表达并降低MMP-9表达——免疫荧光显示MLN增加claudin-5荧光强度，Western blot显示MLN增加ZO-1和occludin蛋白表达并降低MMP-9表达。（4）转录组分析鉴定MLN处理后炎症和免疫相关反应——转录组测序鉴定ICH组与Sham组间1742个上调基因和220个下调基因，MLN组与ICH组间146个上调基因和237个下调基因；GO和KEGG富集分析显示差异基因主要富集于白细胞迁移、趋化因子和细胞因子介导的信号传导、炎症反应调控以及细胞因子–细胞因子受体相互作用、IL-17、NF-κB、趋化因子和Toll样受体信号通路。（5）网络药理学预测MLN–ICH候选靶点和炎症相关通路——鉴定114个共享候选靶点，拓扑分析识别7个高网络中心性候选成分（kaempferol、quercetin、stigmasterol、β-sitosterol、baicalein、luteolin和wogonin）；PPI网络分析识别10个枢纽基因（NFKB1、CXCL8、IL1A、IL6、IL1B、IL4、IFNG、TNF、CCL2和IL10），大多数为细胞因子或炎症介质；KEGG富集分析识别IL-17、TNF、NF-κB、Toll样受体、MAPK和PI3K–Akt信号通路及趋化因子信号和细胞因子–细胞因子受体相互作用。（6）整合分析鉴定MLN逆转的ICH响应基因和三个交叉支持的候选基因——基于差异表达方向鉴定95个MLN逆转的ICH响应基因（31个ICH后下调而MLN后上调，64个ICH后上调而MLN后下调），与114个网络药理学靶点取交集获得F10、Ccl2和Tnf三个交叉支持候选基因；KEGG通路映射将Tnf映射至NF-κB信号通路。（7）MLN降低ICH后NF-κB p65和促炎细胞因子表达——Western blot显示MLN显著降低NF-κB p65、IL-1β、TNF-α、IL-6和CCL2蛋白表达；体外实验显示MLN含药血清显著降低hemin处理BV2细胞的TNF-α、IL-1β和IL-6水平。（8）PMA减弱MLN相关的BBB相关蛋白表达改变——PMA联合处理组NDS高于MLN单药组，NF-κB p65和MMP-9表达增加，occludin和ZO-1表达降低，表明PMA部分逆转了MLN的保护作用。
讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，ICH后神经功能障碍是血肿占位效应和继发性脑损伤的综合结果，MLN改善了神经行为学表现，但高剂量未显示额外获益，可能反映疗效平台期、药物吸收差异或剂量相关不良反应，但缺乏药代动力学和毒性评估，这些解释仍属推测。MRI显示MLN在第3天和第5天减少血肿体积，但第7天差异不再显著，提示MLN对血肿负荷的影响在出血后早期更为突出。MLN降低Evans蓝渗漏和脑含水量，恢复claudin-5、occludin和ZO-1表达，抑制MMP-9表达，提示MLN可能通过维持紧密连接蛋白表达和限制MMP-9相关的屏障降解来保护BBB完整性。转录组分析显示MLN修饰的差异基因主要与白细胞迁移、细胞因子和趋化因子介导的信号传导及炎症反应调控相关，与观察到的组织损伤和BBB破坏减轻相一致。网络药理学独立鉴定114个共享靶点，拓扑分析突出的候选成分（如kaempferol、quercetin、baicalein、luteolin和wogonin等黄酮类化合物）已被报道具有抗炎、抗氧化和神经保护活性。转录组和网络药理学在炎症通路上的汇聚增强了MLN通过协调调控炎症信号而非单一孤立分子靶点发挥作用的可能性。95个MLN逆转的ICH响应基因与114个网络药理学靶点取交集获得F10、Ccl2和Tnf三个交叉支持候选基因，其中Tnf映射至NF-κB信号通路，CCL2是参与单核细胞和其他免疫细胞募集的主要趋化因子，F10编码凝血因子X。Western blot证实MLN降低CCL2和TNF-α蛋白表达。NF-κB p65在ICH后显著升高、MLN后降低，MLN同时降低IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白水平，并伴随MMP-9降低和occludin、ZO-1恢复，提示炎症调控与BBB保护之间存在机制联系。PMA联合处理组NDS更高、NF-κB p65和MMP-9表达增加、occludin和ZO-1表达降低，反向验证了NF-κB相关信号与MLN保护作用的关联。但研究人员也指出，MLN的多组分特性使多靶点、多通路机制成为可能，NF-κB并非唯一通路。局限性包括：仅使用雄性C57BL/6J小鼠；缺乏综合剂量–反应研究、药代动力学分析和安全性评估；缺乏qPCR验证；PMA的非特异性效应及缺乏NF-κB活化的直接测量。未来研究应包括两性动物、开展功能实验（选择性通路抑制剂、p65磷酸化和核转位检测及遗传干预）以进一步验证关键候选基因和NF-κB的参与。
结论部分翻译：买乐宁口服液（MLN）减轻脑出血后神经功能缺损和脑组织损伤，并维持血脑屏障（BBB）功能和结构完整性。转录组学和网络药理学整合分析突出多个炎症相关通路，特别是NF-κB信号通路，作为MLN保护作用的潜在Contributors。此外，蛋白表达分析和PMA干预结果表明，这些效应可能与NF-κB相关炎症反应的调控及MMP-9相关的BBB改变有关。总体而言，这些发现提供了实验证据表明MLN可能至少部分通过调控炎症相关的BBB功能障碍来减轻ICH后继发性脑损伤，并支持其作为ICH潜在多靶点治疗策略的进一步临床前研究。
