工程化乳酸乳球菌用于乳链菌肽诱导的角质形成细胞生长因子递送：阴道上皮修复候选策略的体外评估

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Engineering Lactococcus lactis for nisin-inducible keratinocyte growth factor delivery: in vitro evaluation of a candidate strategy for vaginal epithelial repair

引言： 与雌激素水平生理性下降相关的阴道萎缩会导致黏膜变薄、上皮细胞增殖和分化受损、屏障完整性受损以及感染易感性增加。激素疗法可能引起不良反应并对癌症患者构成风险。角质形成细胞生长因子（KGF）已被提议作为一种局部替代方案，但其快速释放需要每日给药。基因工程改造的乳酸菌为向黏膜表面持续递送治疗性蛋白质提供了一种潜在工具。 方法： 研究人员利用乳链菌肽控制表达（NICE）系统，工程化了一株用于诱导型KGF生产的乳酸乳球菌（L. lactis）菌株。在生成Usp45–KGF融合构建体后，优化了诱导条件以最大化KGF的生产和分泌。通过在皮肤角质形成细胞和阴道上皮细胞系中评估增殖、分化、迁移以及上皮屏障相关标志物，评价了来自产KGF乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的无细胞上清液（CFS-KGF）的生物活性。 结果： 使用10 ng/mL乳链菌肽诱导3小时可获得上清液中最高水平的KGF。CFS-KGF增加了ERK1/2和Akt的磷酸化以及总p38的水平，并通过上调细胞周期蛋白D1和B1促进细胞周期进入。Ki67阳性细胞的比例在24小时从25.3%增加到53.4%，同时伴随着代谢活性的增加。CFS-KGF还促进了细胞骨架重组和细胞迁移，在经丝裂霉素C预处理的细胞的划痕实验中，48小时时将残余开放面积从52.6%减少到25.7%。初始增殖反应之后，在48小时时早期（K1和KRT10）和晚期（IVL、FLG和LORICRIN）分化标志物的表达增加。此外，在24和48小时时，MUC1以及细胞间连接相关转录本（OCLN、TJP1、CDH1和DSG1）出现1.4至5.3倍的增加，表明对阴道上皮屏障具有潜在的有利影响。 讨论： 这些发现支持将工程化乳酸乳球菌作为具有生物活性的重组KGF的来源，其对阴道上皮细胞具有潜在的治疗效果。需要在生理代表性模型和体内（in vivo）中进行进一步研究，以评估其作为阴道萎缩的非激素方法的治疗相关性。

论文解读

研究背景与研究动机

阴道萎缩是绝经后女性常见的健康问题，由雌激素水平生理性下降导致。这会引发阴道黏膜变薄、上皮细胞增殖与分化受损、屏障功能削弱以及对病原体的易感性增加，严重影响生活质量。目前的治疗金标准是局部雌激素给药，但由于显著的全身吸收，它通常在有肿瘤病史的女性中被禁用，并与所有女性的癌症及心血管疾病风险增加有关。植物激素替代配方被证明无效。因此，迫切需要一种能够局部治疗更年期阴道症状且无全身副作用的新型治疗剂。角质形成细胞生长因子（KGF/FGF7）属于成纤维细胞生长因子家族，在调节细胞增殖、迁移和分化中起关键作用，其细胞保护和再生活性对维持成年上皮组织的完整性和功能至关重要。研究人员先前已证明局部施用KGF能有效恢复阴道营养状态，效果类似于阴道内雌激素制剂，且无全身效应风险。然而，游离KGF的快速清除需要频繁给药。为解决此问题，本研究提出利用基因工程改造的安全乳酸菌——乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），通过乳链菌肽控制表达（NICE）系统实现KGF的可控生产与局部持续递送，旨在评估这种基于工程菌的KGF递送平台作为阴道萎缩非激素疗法的潜力。

主要关键技术方法

1. 1.
   基因克隆与表达载体构建：从人真皮成纤维细胞提取总RNA，逆转录获得FGF7 cDNA，并将其与源自乳酸乳球菌的Usp45信号肽编码序列融合，构建Usp45-KGF融合片段。将此片段克隆至pNZ8149表达载体中，得到重组质粒pNZ8149-Usp45-KGF。
2. 2.
   细菌转化与重组菌株构建：将重组质粒通过电穿孔法导入乳酸乳球菌NZ3900电感受态细胞，利用乳糖补充的Elliker培养基筛选阳性转化子（pNZ-KGF）。
3. 3.
   蛋白诱导与样品制备：在细菌指数生长期加入不同浓度（1、5、10 ng/mL）的乳链菌肽进行诱导，收集细胞和无细胞上清液（CFS）。通过SDS-PAGE、Western blotting和ELISA优化诱导条件，确定最佳诱导参数（10 ng/mL乳链菌肽，诱导3小时）。
4. 4.
   细胞生物学功能评价：利用人皮肤角质形成细胞（HaCaT）和人阴道上皮细胞系（VK2/E6E7），通过Western blotting检测信号通路激活（ERK1/2、Akt、p38）；通过免疫荧光检测细胞增殖标志物Ki67和分化标志物角蛋白1（K1）；通过MTT法检测细胞活力；通过TRITC-鬼笔环肽染色观察细胞骨架重排并计算细胞圆度；通过划痕实验评估细胞迁移能力；通过RT-qPCR检测分化相关基因（KRT14, KRT10, TGM1, IVL, FLG, LORICRIN）、屏障相关基因（OCLN, TJP1, CDH1, DSG1）和黏蛋白基因（MUC1）的表达。

研究结果

3.1 重组乳酸乳球菌菌株的构建

成功从人成纤维细胞中扩增出504 bp的FGF7 cDNA片段。将其与Usp45信号肽编码序列融合后，克隆至pNZ8149载体，构建了重组质粒pNZ8149-Usp45-KGF。测序证实插入序列正确且读码框无误。将该质粒电转入乳酸乳球菌NZ3900，成功筛选出重组菌株pNZ-KGF。

3.2 KGF蛋白表达与分泌条件的优化

通过SDS-PAGE和Western blotting分析，在乳链菌肽诱导的细胞裂解液和上清液中均检测到约18 kDa的特异性KGF条带，未诱导组无此条带。ELISA定量结果显示，使用10 ng/mL乳链菌肽诱导3小时可获得上清液中最高浓度的KGF，而延长诱导时间至24小时会导致KGF量下降。

3.3 KGF对人上皮细胞的生物学效应

用CFS-KGF处理HaCaT和VK2/E6E7细胞后，显微镜观察显示细胞形态正常但密度更高。Western blotting分析表明，CFS-KGF处理15分钟即可显著增加两种细胞中ERK1/2和Akt的磷酸化水平以及总p38的表达水平，表明其激活了MAPK和PI3K/Akt信号通路。

3.4 KGF对人阴道细胞增殖的影响

在VK2/E6E7细胞中，CFS-KGF处理上调了细胞周期蛋白D1和B1的表达。免疫荧光结果显示，CFS-KGF组中Ki67阳性细胞比例在24小时（53.4% vs. 25.3%）和48小时（20.5% vs. 10.9%）均显著高于对照组。MTT实验也证实CFS-KGF能显著提高细胞的代谢活性。

3.5 KGF对人阴道细胞迁移的影响

TRITC-鬼笔环肽染色显示，CFS-KGF处理后，VK2/E6E7细胞发生明显的细胞骨架重排，形成板状伪足，细胞圆度显著降低（0.55 vs. 0.59），提示细胞获得更利于迁移的伸长形态。在经丝裂霉素C预处理抑制增殖的划痕实验中，CFS-KGF组的残余开放面积在12小时和48小时均显著小于对照组（48小时：25.7% vs. 52.6%），证实其促进了细胞迁移。

3.6 KGF对阴道细胞分化相关标志物的影响

免疫荧光和RT-qPCR分析显示，CFS-KGF处理24小时时，早期分化标志物角蛋白1（K1）和KRT10表达下调，这与此时强烈的增殖效应一致。而在48小时，随着增殖减弱，K1、KRT10以及中间分化标志物TGM1的表达显著上调。同时，基底细胞标志物KRT14表达下降，晚期分化标志物IVL、FLG和LORICRIN的表达也在48小时时显著升高。这表明CFS-KGF能诱导一个时序性响应：先促进增殖，随后驱动分化。

3.7 KGF对阴道上皮屏障相关标志物的影响

RT-qPCR结果表明，CFS-KGF在24小时和48小时均能显著上调紧密连接蛋白（OCLN、TJP1）、粘附连接蛋白（CDH1）和桥粒蛋白（DSG1）的mRNA水平，且在48小时时上调幅度更大。Western blotting验证了E-钙黏蛋白（E-cadherin）蛋白水平在48小时时的增加趋势。此外，CFS-KGF还能显著增加黏蛋白MUC1的mRNA表达，提示其对阴道上皮黏液层和屏障保护具有积极作用。

讨论与结论总结

本研究成功构建了一株能受乳链菌肽诱导分泌生物活性KGF的重组乳酸乳球菌。体外实验证明，该菌株产生的KGF能够激活关键的细胞内信号通路（MAPK和PI3K/Akt），并有效促进人阴道上皮细胞的增殖、迁移和分化，同时上调多种与上皮屏障功能和黏液分泌相关的基因表达。这一系列效应模拟了KGF对上皮组织的生理作用，即先刺激基底层细胞增殖，再调控终末分化。

与现有非激素疗法（如润滑剂、保湿剂和植物雌激素）相比，本研究提出的策略通过靶向上皮细胞FGFR2b受体发挥作用，不涉及雌激素受体，因此理论上适用于有激素敏感性肿瘤史的患者。与直接局部施用重组KGF相比，活菌载体有望实现持续的局部药物释放，从而减少给药频率，并可能降低纯化蛋白的生产成本。

研究结论：这些发现支持将工程化的乳酸乳球菌作为具有生物活性的重组KGF的来源，其对阴道上皮细胞具有潜在的治疗效果。未来需在生理代表性模型和体内（in vivo）研究中进一步评估其作为阴道萎缩非激素治疗手段的治疗相关性。