《Frontiers in Immunology》：Peripheral T- and B-cell immune signatures in early Alzheimer’s disease
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背景：神经炎症和外周适应性免疫失调被认为参与阿尔茨海默病（AD）的发病机制，但外周免疫改变是否在最早的生物标志物定义阶段即可检测尚不清楚。大多数免疫表型研究纳入的是临床确诊痴呆的患者，而未经过生物标志物确认。方法：研究人员开展了一项前瞻性、观察性、单中心研究，
背景：神经炎症和外周适应性免疫失调被认为参与阿尔茨海默病（AD）的发病机制，但外周免疫改变是否在最早的生物标志物定义阶段即可检测尚不清楚。大多数免疫表型研究纳入的是临床确诊痴呆的患者，而未经过生物标志物确认。方法：研究人员开展了一项前瞻性、观察性、单中心研究，连续纳入认知正常或轻度认知障碍的成年人（MMSE >22；CDR 0–0.5）。参与者根据脑脊液（CSF）和血液生物标志物分为生物标志物定义的AD组、其他痴呆组（OD）和非退行性认知主诉组（NDC）。通过多参数流式细胞术进行外周血表面标志物免疫表型分析，表征B细胞和T细胞区室，包括调节性T细胞（Tregs）、常规辅助性T细胞（Th）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）及双重阴性T细胞亚群。组间比较采用Benjamini-Hochberg校正的参数和非参数检验。探索性分析包括主成分分析（PCA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）、免疫亚群与AD生物标志物之间的相关性，以及通过ROC分析评估的区分AD与NDC的 logistic 回归模型。结果：共纳入79名参与者（AD n=43，OD n=18，NDC n=18）。经多重检验校正后，生物标志物定义的AD与NDC之间未检测到任何淋巴细胞群体的显著差异。最明显但幅度较小的多变量分离出现在AD与OD之间，由OD组中Th17样调节性T细胞和Th9样细胞的频率名义上较高所驱动，但除年龄和性别校正的AD与OD比较中的Th17样调节性T细胞外，其余均未通过校正。双重阴性γδ T细胞在AD中较NDC数值上降低但无统计学意义，包含双重阴性T细胞亚群的探索性logistic模型达到中等区分度（AUC 0.743），但未经外部验证。免疫亚群与AD生物标志物之间的相关性较弱；最明显的是Th17样调节性T细胞与CSF神经丝轻链（NfL）之间的相关性，而非与淀粉样蛋白-β（Aβ）或tau蛋白。结论：在生物标志物定义的早期AD与NDC之间未检测到外周适应性免疫谱的显著差异，提示在阿尔茨海默病连续体的最早阶段，明显的外周免疫激活尚未建立。AD与OD之间的探索性差异涉及Th17样调节性T细胞和Th9样细胞，可能反映活跃神经退行性变中的Treg可塑性和IL-9轴激活，值得进行功能性验证。这些特征不应被视为早期AD检测的候选生物标志物。
研究背景：阿尔茨海默病（AD）是全球痴呆症的首要病因，其神经病理学特征为细胞外淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块沉积和细胞内过度磷酸化tau蛋白神经原纤维缠结形成。载脂蛋白E（APOE）基因型，尤其是?4等位基因，显著调节遗传风险。近年来，神经炎症被认为是AD病理生理学的积极贡献者而非次要伴随现象。在适应性免疫系统中，外周T细胞可能通过受损的血脑屏障进入中枢神经系统（CNS），促炎性CD4+亚群（如Th1和Th17细胞）通过释放干扰素-γ、白细胞介素-17和肿瘤坏死因子-α促进小胶质细胞激活和神经毒性。相反，调节性T细胞（Tregs）可通过免疫抑制性细胞因子抑制神经炎症。然而，既往关于AD外周免疫改变的研究结果不一致，且大多数研究纳入的是临床确诊痴呆患者，未经生物标志物确认，免疫改变可能反映晚期神经退行性变、衰弱或非特异性炎症衰老而非AD特异性病理。一个关键未解决的问题是外周适应性免疫改变是否在AD最早期阶段即可检测，特别是当诊断基于生物标志物标准而非仅凭临床表现时。为此，研究人员在一个前瞻性队列中表征了早期认知障碍患者的外周适应性免疫格局，这些患者根据生物标志物诊断为早期AD、其他痴呆（OD）和非退行性认知主诉（NDC），使用多参数流式细胞术分析主要B细胞和T细胞区室，并探索其与既定AD生物标志物和诊断组别的关系。
研究方法：研究人员开展了一项前瞻性、观察性、单中心研究，在西班牙瓦伦西亚La Fe大学医院神经内科认知障碍单元进行，于2025年7月至12月连续筛查因认知主诉或疑似早期认知障碍首次就诊的成年患者。纳入标准为MMSE评分>22且CDR评分0–0.5的早期认知障碍阶段患者。排除标准包括既往确诊AD或其他痴呆、更晚期认知障碍、严重神经或精神疾病可能干扰认知评估者，以及已知原发性或继发性免疫缺陷、HIV、活动性恶性肿瘤治疗中、近10年内化疗、实体器官移植、造血干细胞移植或正在接受全身免疫抑制治疗者。最终诊断分类在完成临床、神经心理学、影像学和生物标志物评估后确定。AD组纳入符合阿尔茨海默病协会工作组修订标准的生物标志物诊断AD患者，定义为至少一个异常Core 1生物标志物（CSF Aβ42/Aβ40比值<0.069、CSF t-tau/Aβ42比值>0.51或血浆p-tau217>0.29 pg/mL）。OD组包括非阿尔茨海默神经退行性或血管性认知障碍患者。NDC组包括因主观或客观认知症状转诊但经影像学、CSF和血液生物标志物排除AD和其他痴呆的患者。关键技术方法包括：CSF Aβ1–40、Aβ1–42、t-tau、p-tau181和NfL通过化学发光酶免疫分析法（CLIA）在Lumipulse? G平台上测定；血浆p-tau217和血清NfL在可用时测定；APOE基因型通过实时PCR确定；神经心理学评估使用CDR量表、MMSE和可重复电池神经心理状态评估（RBANS）；外周血免疫表型分析通过多参数流式细胞术使用EuroFlow原发性免疫缺陷定向管（PIDOT）面板（包括CD45、CD3、TCRγδ、CD4、CD8、CD27、CD45RA、CD19、IgD、IgM、CD16和CD56标记），在BD FACSLyric?流式细胞仪上采集，使用Infinicyt?软件分析；补充CD4+ T细胞免疫表型面板用于详细表征调节性、常规辅助性和滤泡辅助性T细胞区室。统计分析包括Benjamini-Hochberg错误发现率校正、协方差分析（ANCOVA）校正年龄和性别、主成分分析（PCA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）、弹性网络正则化惩罚逻辑回归、Spearman秩相关分析和探索性多变量逻辑回归模型及ROC曲线分析。
研究结果：
研究人群和基线特征：共纳入79名参与者（AD n=43，OD n=18，NDC n=18）。OD组包括2例路易体病、1例非典型帕金森综合征、2例额颞叶痴呆、4例血管性认知障碍、3例其他或未确定神经退行性疾病及6例混合或 predominantly 非神经退行性原因的认知障碍。NDC组认知症状归因于情感障碍（n=6）、其他精神共病（n=1）、药物相关认知障碍（n=3）或多因素认知障碍（n=2），6例未确定具体原因。APOE ?4携带者在AD组更常见（41.9%），OD组16.7%，NDC组11.1%。三组间年龄、性别、酒精消费、烟草暴露、社会经济地位及主要血管代谢共病（高血压、糖尿病、血脂异常、脑血管病、慢性缺血性心脏病）和伴随药物暴露均无显著差异。MMSE评分在三组间无显著差异（AD 24.9±4.36，OD 26.2±3.19，NDC 26.9±2.50）。正如基于生物标志物的诊断分类所预测，AD组的CSF Aβ42水平和CSF Aβ42/Aβ40比值低于OD和NDC组，而CSF总tau、CSF p-tau181、CSF总tau/Aβ42比值和血浆p-tau217较高，这些差异经多重比较校正后仍显著。
外周血液学和整体淋巴细胞谱：全血细胞计数参数包括血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞计数在各诊断组间可比，经BH校正后无显著差异。绝对CD45+淋巴细胞计数在三组间相似（AD 2034.9±649.6，OD 2196.1±785.5，NDC 2093.4±711.1；BH校正p=0.821）。NK细胞和NKT细胞的相对频率或绝对计数均无显著差异。
B细胞区室：外周B细胞亚群分布在各诊断组间无显著差异。总B细胞频率和绝对计数在AD、OD和NDC之间可比。同样，初始B细胞、生发中心后B细胞、未转换生发中心后B细胞、类别转换生发中心后B细胞和IgD阳性生发中心后B细胞在多重检验校正后均无显著组间差异。
T细胞分化、双重阴性T细胞及调节性/辅助性T细胞亚群：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的总体分布在各诊断组间相似。经多重检验校正后，初始、中央记忆、效应记忆或终末效应CD4+和CD8+ T细胞亚群均无显著差异。双重阴性T细胞亚群在校正前后均无统计学显著组间差异。双重阴性γδ T细胞在NDC中数值上高于AD和OD（5.37±3.89 vs. 4.04±3.25和3.32±2.78；未校正p=0.094；校正p=0.658）。在调节性T细胞区室中，总调节性T细胞和效应记忆调节性T细胞在各诊断组间无显著差异。Th17样调节性T细胞显示名义组间差异，OD组高于AD和NDC组（30.1±6.73 vs. 24.8±4.88和23.3±8.13；未校正p=0.026），但经BH校正后不显著（校正p=0.366）。在常规辅助性和滤泡辅助性T细胞亚群中，Th9样细胞显示名义组间差异，OD组高于AD和NDC组（26.8±13.9 vs. 18.7±6.48和18.5±7.60；未校正p=0.024），但校正后不显著（校正p=0.531）。年龄和性别校正分析产生较小的校正平均差异，95%置信区间通常以零为中心，标准化效应量（Cohen‘s d）主要在较小范围内。例外的是Th17样调节性T细胞，AD组低于OD组（β ?5.75，95% CI ?9.21至?2.30；Cohen’s d ?1.09；BH校正p=0.022），这是唯一在校正后仍显著的差异。总体而言，这些发现不支持各组间大多数外周T细胞亚群存在大差异，但置信区间的宽度不允许排除小到中等效应。
探索性多变量免疫细胞特征：主成分分析（PCA）包括Th17样调节性T细胞、Th9样细胞、NK细胞、NKT细胞、双重阴性非γδ T细胞和双重阴性γδ T细胞，前两个主成分分别解释21.0%和19.6%的总方差，合计40.6%。PCA可视化显示AD、OD和NDC参与者之间存在大量重叠，表明前两个成分中无完全诊断分离。然而，OD参与者在PC1和PC2正值方向显示更广泛的离散，提示部分多变量免疫细胞变异。在PCA载荷分析中，PC1主要由Th17样调节性T细胞（载荷=0.607）和Th9样细胞（载荷=0.549）的正贡献以及NK细胞的负贡献（载荷=-0.541）表征。PC2主要由NKT细胞正向驱动（载荷=0.711），而双重阴性γδ T细胞（载荷=-0.530）和双重阴性非γδ T细胞（载荷=-0.428）在相反方向贡献。包含诊断组、年龄和性别的PERMANOVA模型显示与选定免疫细胞距离矩阵的显著全局关联，解释13.1%的总方差（R2=0.131，F=2.412，p=0.003）。在成对比较中，AD和OD在多重检验校正后差异显著（R2=0.151，F=2.953，校正p=0.006）。NDC与OD比较显示名义差异但校正后不显著（R2=0.179，F=1.891，未校正p=0.043；校正p=0.065），而NDC与AD之间无显著差异（R2=0.074，F=1.335，校正p=0.222）且大量重叠。标准化Z分数剖面显示OD参与者Th17样调节性T细胞和Th9样细胞相对较高，而NDC参与者双重阴性非γδ和γδ T细胞亚群趋于较高，AD参与者显示较平坦的剖面。作为补充监督分析，弹性网络正则化未在AD与NDC、AD与合并非AD组或OD与NDC比较中识别出稳定的预测因子组合，交叉验证偏差在所有α评估中均在最大惩罚处最小化，所有系数收缩至零。相反，在AD与OD比较中，最优模型对应LASSO解，在lambda.min处保留Th17样调节性T细胞、Th9样细胞和年龄（标准化β分别为0.46、0.26和?0.07），而在lambda.1se处仅保留Th17样调节性T细胞（β=0.15）。折外AUC为0.694（95% CI 0.510-0.877），表明中等但估计不精确的区分度。探索性相关分析显示选定免疫细胞亚群与AD相关生物标志物之间总体关联较弱。层次聚类热图分析未识别出主导的免疫-生物标志物相关模式。Th17样调节性T细胞与CSF神经丝轻链显示最明显的探索性正相关（ρ=0.287；p=0.019；BH校正p=0.937），而双重阴性T细胞亚群倾向于与多个生物标志物变量显示弱负相关。
探索性区分生物标志物定义AD与NDC的模型：最后，使用年龄、性别、双重阴性γδ T细胞和双重阴性非γδ T细胞在59名完整数据参与者（41例AD和18例NDC）中拟合探索性多变量逻辑回归模型以区分AD与NDC。 aucun个体预测因子与AD状态显著相关。年龄显示与AD分类的非显著正相关（OR 1.067，95% CI 0.990-1.177），而双重阴性γδ T细胞（OR 0.877，95% CI 0.733-1.042）和双重阴性非γδ T细胞（OR 0.413，95% CI 0.099-1.414）显示非显著负相关。尽管无显著个体预测因子，组合模型显示中等区分性能，AUC为0.743（95% CI 0.605–0.880）。根据Youden指数确定最优分类阈值为0.671，灵敏度为78.0%（32/41；95% CI 39.0–95.1%），特异度为66.7%（12/18；95% CI 44.4–100%）。当同样四个预测因子进入弹性网络模型时，交叉验证选择岭惩罚（α=0）；在lambda.min处，标准化系数相对于未惩罚估计收缩45–53%，方向不变，在lambda.1se处所有四个系数收缩至接近零；惩罚模型的折外AUC为0.617（95% CI 0.462–0.771）。鉴于分析的探索性、有限样本量、性能估计的宽置信区间及缺乏外部验证，该模型不应被视为早期AD检测的候选临床血液生物标志物，而应视为假设生成性发现，需在更大独立队列中确认。
讨论部分总结：本研究表征了生物标志物定义的早期认知障碍患者队列的外周适应性免疫格局，揭示四项主要发现。第一，经多重检验校正后，生物标志物定义的AD与NDC之间在主要淋巴细胞群体频率上未检测到显著差异。第二，最明显的探索性多变量免疫差异出现在AD与OD之间而非AD与NDC之间，主要由OD组中Th17样调节性T细胞和Th9样细胞名义上较高频率驱动，除年龄和性别校正的AD与OD比较中的Th17样调节性T细胞外，其余未通过多重检验校正。第三，双重阴性γδ T细胞在早期AD中较NDC数值上降低但无统计学意义，两种双重阴性T细胞亚群在探索性逻辑回归模型中显示与AD分类的非显著负相关，模型具有中等区分性能。第四，外周免疫亚群与AD相关生物标志物之间的相关性总体较弱，最明显的关联是Th17样调节性T细胞与CSF神经丝轻链而非淀粉样蛋白-β或tau标记。生物标志物定义AD中缺乏显著外周适应性免疫改变与临床明显AD中广泛报道的免疫失调形成对比，但这一表面差异应在疾病阶段背景下解释：大多数既往免疫表型研究纳入临床诊断AD痴呆患者且常未经生物标志物确认，而本队列 comprised 阿尔茨海默病连续体最早期阶段的个体。研究人员认为，外周适应性免疫失调可能不是AD的构成性特征，而是随疾病进展演变的动态过程，随着神经退行性变进展而更加明显。然而，无统计学显著差异不应解释为等效性证据：在本样本量下，仅能可靠检测中到大效应，较小效应可能被遗漏。从病理生理学角度看，若在更大队列中确认，早期AD中观察到的平坦免疫表型剖面将与神经炎症在此阶段主要局限于中枢神经系统内一致。本研究的一个显著发现是最明显的免疫表型差异出现在AD与OD之间而非AD与NDC之间。在补充多变量方法中，PERMANOVA显示AD与OD之间显著但幅度较小的差异，而PCA和惩罚回归指向Th17样调节性T细胞和Th9样细胞作为该模式的主要贡献者。OD组中Th17样化学因子受体表型的Treg频率较高可能反映活跃神经退行性变背景下的Treg可塑性，但本研究未评估FoxP3表达或抑制功能。调节性T细胞并非均质群体，而表现出显著可塑性，在炎症条件下能够获得效应样表型同时部分保留调节身份。在富含IL-6、IL-23和TGF-β的慢性炎症环境中——如血管性痴呆、路易体病或额颞叶痴呆的全身环境——Treg可能从抑制程序失稳并通过外周转化向Th17样表型偏移。Th17样Treg与CSF神经丝轻链之间弱的探索性正相关与以下可能性兼容但不确立：该表型追踪神经元损伤强度而非特定病因通路。值得注意的是，与核心AD病理标志物包括Aβ42、磷酸化tau或其比值未出现有意义的相关性。OD中Th9样细胞频率名义上较高在有限但新兴的Th9细胞参与神经退行性变的证据背景下值得关注，但在缺乏IL-9测量的情况下，本研究所研究的表面定义群体与产生IL-9的Th9细胞之间的对应关系仍不确定。Th9细胞是独特的CD4+辅助亚群，在TGF-β和IL-4共同影响下产生IL-9，根据组织背景具有促炎和免疫调节功能。Th9细胞的显著特征是广泛的趋化因子受体谱，共表达CCR3、CCR6和CXCR3——通常分别与Th2、Th17和Th1谱系相关的受体——赋予其迁移至几乎任何炎症部位的能力。在神经退行性变背景下，CNS炎症期间CCR6和CXCR3配体被诱导，Th9细胞原则上可有效迁移至神经元损伤部位。在评估的免疫细胞亚群中，双重阴性γδ T细胞显示最具生物学意义的模式之一。尽管差异未达统计学显著性，甚至在多重检验校正前，循环双重阴性γδ T细胞在AD中较NDC数值上降低。两种双重阴性T细胞亚群在探索性逻辑回归模型中显示与AD分类的非显著负相关。这些观察提出假设：循环双重阴性T细胞水平降低伴随AD病理最早阶段。两种推测性、非互斥的解释可考虑：第一，保护性或调节性双重阴性T细胞群体可能响应早期AD相关信号从外周血重新分布至脑膜或实质区室，导致循环水平降低；第二，慢性暴露于淀粉样蛋白相关危险信号可能驱动这些细胞向终末效应状态或耗竭，减少标准免疫表型可识别的循环池。本研究存在若干局限性：中等样本量特别是对照组限制了统计功效，仅能可靠检测中到大差异，AD与NDC之间无显著差异可能反映II型错误，不应解释为等效性证据；横断面设计无法得出因果关系或外周免疫改变随时间演变的结论；OD组 comprised 异质性非AD痴呆群体且每种病因参与者数量少，无法进行亚型特异性分析，AD与OD之间观察到的免疫差异可能由OD组组成驱动而非AD特异性生物学；NDC组包括情感障碍、精神共病或药物相关认知障碍个体，这些状况本身可能影响外周免疫；尽管年龄和性别在校正和多变量分析中加以考虑，但年龄、性别、共病和他汀类、抗抑郁药或吸入性皮质激素等伴随药物的残余混杂不能排除；APOE ?4在AD组富集，但组外携带者和小型纯合子数量少，无法进行APOE分层分析。此外，免疫表型面板仅限于细胞表面标志物，未包括细胞内FoxP3或细胞因子染色、功能测定或细胞迁移测量。Treg通过CD25highCD127low替代表型鉴定，该表型与FoxP3表达强相关但不一定反映抑制能力。Th9样细胞仅通过趋化因子受体表达定义，可能不完全反映其IL-9产生状态。最后，探索性逻辑回归模型在外部验证前不应被视为早期AD检测的候选临床生物标志物。此外，由于未进行配对血液-CSF免疫表型分析，重分布假设仍未经验证。
研究结论翻译：总之，经多重检验校正后，生物标志物定义的早期AD与NDC之间未检测到外周适应性免疫细胞谱的显著差异，提示在阿尔茨海默病连续体的最早阶段，明显的外周免疫激活尚未建立。主要的探索性多变量分离出现在AD与OD之间，由OD组中Th17样调节性T细胞和Th9样细胞名义上较高的频率驱动。尽管这些差异未通过多重检验校正（除年龄和性别校正的AD与OD比较中的Th17样调节性T细胞外），但它们识别出可能反映活跃神经退行性变中Treg可塑性和IL-9轴激活的亚群，并提示外周免疫谱分析对于痴呆类型间的鉴别诊断可能比早期检测AD更具信息价值，这一可能性值得在更大队列中评估。AD中观察到的循环双重阴性γδ T细胞水平降低虽无统计学显著性，但与尚未验证的早期免疫向CNS重分布假设兼容，需要配对血液-CSF免疫表型分析来检验。鉴于探索性设计，这些特征不应被视为早期AD检测的候选生物标志物，但它们为未来验证研究提供了可检验的假设。这些发现促使重新考虑外周适应性免疫改变沿AD连续体的时间性和区室化，并强调需要纵向研究结合功能性免疫测定、配对血液-CSF分析以及与既定生物标志物框架的整合，以阐明外周免疫在AD发病机制最早阶段的作用。
