基于透明质酸的共递送疫苗通过主动淋巴结靶向增强体液免疫应答

《International Journal of Pharmaceutics》：Hyaluronic acid based codelivery vaccine enhances humoral immunity through active lymph node targeting

抗原和佐剂高效共递送至次级淋巴器官是亚单位疫苗开发中的关键挑战，旨在增强免疫原性同时最小化全身副作用。尽管多种纳米载体系统已被探索用于淋巴靶向，但许多依赖于被动引流或非特异性细胞摄取，缺乏用于有效淋巴结（LNs）积累的主动靶向机制。在此，研究人员通过将SARS-CoV-2 S1亚基和TLR7/8激动剂3M-052共价缀合到透明质酸（HA）骨架上，构建了一种淋巴结靶向疫苗，命名为HA-3M-052-S1。研究人员系统评估了其与淋巴内皮受体LYVE-1的结合能力、淋巴结靶向效率以及在小鼠中的免疫原性。结果表明，HA-3M-052-S1对LYVE-1表现出高亲和力结合，并在注射后4小时内迅速积聚于引流淋巴结（dLNs）。与铝佐剂或简单混合制剂相比，该疫苗诱导了显著更高频率的滤泡辅助性T细胞和生发中心B细胞。此外，它引发了强效且持久的抗原特异性抗体应答，其中和抗体滴度大幅超过对照组。重要的是，该共交联疫苗提供的针对SARS-CoV-2攻击的保护作用与腺病毒载体疫苗相当。本研究建立了一种通过HA-LYVE-1相互作用的主动淋巴结靶向策略，并为具有增强效力和安全性的下一代亚单位疫苗提供了一个稳健的平台。

论文解读

一、研究背景与目的

亚单位疫苗的功效关键取决于抗原和佐剂能否高效递送至次级淋巴器官（SLOs），特别是淋巴结（LNs），因为这里是初始淋巴细胞遇到抗原呈递细胞并启动适应性免疫应答的场所。靶向递送至LNs不仅能增强疫苗免疫原性，还能在空间上限制佐剂活性，从而提高安全性。例如，将Toll样受体（TLR）配体引导至LN内的树突状细胞（DCs），可以显著增强佐剂效果，且所需剂量远低于可溶性给药。同样，利用白蛋白结合策略将抗原导向LNs可增强T细胞启动和整体疫苗效力。这些观察确立了LN靶向递送是改善亚单位疫苗性能的有效方法。

目前已开发出多种促进淋巴递送的策略，包括基于纳米颗粒的系统、直接淋巴管内注射以及生物聚合物介导的抗原交联。然而，依赖被动淋巴引流的策略通常缺乏分子特异性，且需要大量的配方优化。另一种替代策略是主动的、受体介导的靶向。透明质酸（HA）是细胞外基质的主要成分，由重复的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺单元组成，因其优异的生物相容性和广泛的组织分布而成为有吸引力的候选材料。至关重要的是，HA是淋巴管内皮受体1（LYVE-1）的天然配体，该受体在淋巴内皮细胞上组成性表达，并介导HA从组织进入淋巴系统的转运。

HA-LYVE-1轴介导多种生物学转运过程。DCs合成内源性HA并将其呈递在表面以结合淋巴内皮上的LYVE-1，形成“迁移杯”结构以促进其向引流LNs的转运。病原体如A族链球菌也利用相同机制，将自己包裹在高分子量HA中以结合LYVE-1并扩散至LNs。这些自然先例启发了将HA理性设计为LN靶向递送载体的思路。将抗原缀合到HA上可促进其快速转运至引流LNs并放大抗原特异性免疫。HA也被用于递送小分子免疫佐剂如TLR7/8激动剂，实现了局限于LN内的强效免疫刺激，同时减少了全身暴露。

尽管取得了这些进展，但将抗原和TLR激动剂两者共价共交联到单个HA骨架上是否能同时实现主动LN靶向和增强的免疫原性，此前尚未被探索。因此，研究人员设计了HA-3M-052-S1，其中SARS-CoV-2刺突S1亚基和TLR7/8激动剂3M-052通过连续的EDC/NHS化学法共价交联到单一HA主链上。这种架构有望实现LYVE-1介导的LN靶向，并产生优于非共价制剂的体液和细胞免疫。

二、关键技术方法

1. 1.
   疫苗合成：采用两步EDC/NHS交联法构建HA基共交联疫苗。首先将TLR7/8激动剂3M-052共价缀合至HA的羧基上，纯化得到中间体HA-3M-052；随后将其重新活化并与SARS-CoV-2刺突S1亚基缀合，最终获得HA-3M-052-S1。
2. 2.
   表征技术：利用紫外-可见光谱和¹H核磁共振确认3M-052的成功缀合；通过抗S1蛋白质印迹法证实S1的共价连接并计算缀合效率；使用动态光散射测量水合粒径，透射电子显微镜观察形态，Zeta电位分析仪测定表面电荷。
3. 3.
   体内成像与靶向验证：通过活体荧光成像和离体引流淋巴结成像评估疫苗的淋巴结靶向效率。利用小鼠LYVE-1瞬时转染的HEK293T细胞进行流式细胞术结合实验，并通过抗mLYVE-1阻断抗体实验验证LYVE-1依赖性。
4. 4.
   免疫学分析：采用流式细胞术分析引流淋巴结中树突状细胞（DCs）的活化状态（CD86表达）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）和生发中心B细胞（GCB）的比例。通过酶联免疫吸附试验检测抗原特异性抗体及其亚类（IgG1、IgG2a）滴度。使用假病毒中和试验测定中和抗体滴度（NT₅₀）。通过IFN-γ ELISpot评估脾细胞的T细胞应答。
5. 5.
   攻毒保护实验：在K18-hACE2转基因小鼠模型中，以野生型SARS-CoV-2株进行鼻内攻毒，通过RT-qPCR定量肺组织中病毒RNA拷贝数，并以噬斑法测定感染性病毒滴度来评价保护效力。
6. 6.
   安全性评价：监测小鼠体重变化，检测血清中炎症因子（IL-6、IL-12）水平以及临床生化指标（ALT、AST、ALP、LDH、UA）。

三、研究结果

2.1 HA基共交联疫苗的合成与表征

研究人员通过两步EDC/NHS交联成功构建了HA-3M-052-S1。UV-Vis和¹H NMR证实3M-052成功缀合，含量约为1.58%（w/w）。抗S1 Western blot显示S1的缀合效率高达99.6%，S1与HA的摩尔比约为1:2。表征结果显示，该缀合物呈负电性，Zeta电位约-43 mV；TEM观察到约40 nm的电子致密核心；DLS测得水合粒径约363 nm，多分散系数为0.49。稳定性实验表明，在4°C、25°C和37°C下储存7天后，S1和3M-052均保持高度结合。ACE2结合实验显示，随机缀合导致S1的部分抗原表位被遮蔽，ACE2结合能力下降了约30%。

2.2 HA-3M-052-S1展现高效的淋巴结靶向能力

体外实验中，HA-Cy5-S1与过表达小鼠LYVE-1的HEK293T细胞结合率（20.4%）显著高于对照细胞（2.69%），证实了特异性结合。体内成像显示，HA-Cy5-S1在注射部位滞留并持续累积至引流淋巴结，而游离S1-Cy5或物理混合物则快速清除。离体成像定量分析表明，HA-Cy5-S1组的引流淋巴结荧光强度从1小时起即可检测，并随时间递增至24小时，显著高于其他组。抗mLYVE-1阻断抗体预处理可使引流淋巴结荧光降低约39%，直接证明了HA-LYVE-1相互作用介导了该靶向过程。

2.3 HA-3M-052-S1增强引流淋巴结中树突状细胞活化和生发中心反应

流式细胞术分析显示，免疫后24小时，HA-3M-052-S1能显著上调引流淋巴结中驻留DC和迁移DC上的CD86表达。值得注意的是，物理混合物组诱导的CD86水平甚至更高，这可能归因于游离3M-052的直接生物利用度。然而，在免疫后14天，HA-3M-052-S1组诱导了更强的Tfh细胞（CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺）和GCB细胞（CD19⁺GL7⁺FAS⁺）应答，其频率和绝对数量均显著高于铝佐剂组和物理混合物组。

2.4 HA-3M-052-S1诱导高水平且持久的免疫应答

经过两针免疫，HA-3M-052-S1组诱导的抗原特异性结合抗体终点滴度比铝佐剂组和物理混合物组分别高出约10倍和4倍。假病毒中和抗体GMT达到5313，远高于铝佐剂组（256）和混合物组（683）。该疫苗还诱导了平衡的IgG1/IgG2a抗体亚类比例，提示混合的Th1/Th2型免疫极化。纵向监测12周发现，HA-3M-052-S1诱导的中和抗体更持久，在第12周仍保留约45%的峰值水平。此外，该疫苗还显著增强了抗原特异性IFN-γ T细胞应答。通过比较五种不同制剂，研究人员证明只有完整的共价共交联疫苗才能产生显著的免疫增强效果，而部分缀合或物理混合的HA基制剂均未能超越铝佐剂。

2.5 HA-3M-052-S1在转基因小鼠中提供针对SARS-CoV-2攻击的保护

在K18-hACE2转基因小鼠攻毒模型中，与PBS对照组相比，HA-3M-052-S1免疫组小鼠肺组织中的病毒RNA拷贝数降低了约1.5个对数级，感染性病毒滴度降低了约4个对数级。该保护效果与已上市的腺病毒载体疫苗Ad5-nCoV相当，两组间无统计学差异。

2.6 HA-3M-052-S1展现出良好的安全性

安全性评估显示，HA-3M-052-S1组小鼠体重未出现下降。血清细胞因子分析表明，虽然HA-3M-052-S1和物理混合物组在6小时均引起IL-12升高，但HA-3M-052-S1组的IL-12水平显著低于混合物组，且所有组的IL-6和IL-12在24小时均恢复至基线。临床生化指标检测显示，HA-3M-052-S1组在第7天和第14天的各项指标均与PBS组相当，而铝佐剂组在第7天出现了乳酸脱氢酶和尿酸的短暂升高。

四、讨论与结论

讨论部分总结：

本研究开发了一种基于抗原和佐剂共价共交联至单一HA骨架上的淋巴结靶向亚单位疫苗平台。三个关键发现如下：首先，HA缀合能够实现主动的、LYVE-1介导的LN靶向，这是被动引流或物理混合物无法实现的。其次，共价共递送而非物理混合物，尽管诱导了较低的急性DC活化，却能转化为有效的生发中心反应，这表明同步化的抗原-佐剂共定位比单纯先天刺激的强度更能决定免疫原性。第三，这种设计产生了持久的抗体应答、抗原特异性T细胞免疫和针对SARS-CoV-2的攻击保护，且无全身毒性。这些结果表明，共价HA基共递送具有超越简单共配方的免疫学优势。

研究人员承认当前方法的若干局限性：首先，非位点特异性的赖氨酸导向缀合部分降低了S1的ACE2结合活性，未来的工作将聚焦于位点特异性缀合策略。其次，虽然本研究展示了关键的免疫学结果，但更全面的免疫学表征还需包括更广泛的DC表型分析、细胞内细胞因子染色以区分CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群、多个时间点的纵向GC分析以及记忆B细胞和骨髓长寿命浆细胞的直接定量。

研究结论：

总之，研究人员提出了一种基于HA共交联的淋巴结靶向亚单位疫苗平台，该平台协同了主动的LYVE-1介导的淋巴递送与共价抗原-佐剂共递送。这一组合策略产生的免疫原性超越了传统的铝佐剂和简单混合制剂，产生了持久的中和抗体、抗原特异性T细胞免疫和攻击保护，且未检测到全身毒性。与共价键合的疫苗成分相同但缺乏共价连接的物理混合物未能重现这些结果，这强调了同步化共定位是关键的设计参数。该研究工作验证了共价HA基共递送作为下一代亚单位疫苗通用策略的可行性。