单核转录组图谱揭示拟南芥茎向重力性内皮层基因调控网络

《Journal of Advanced Research》：A single-nucleus transcriptomic atlas reveals the endodermal gene regulatory network underlying Arabidopsis stem gravitropism

向重力性（gravitropism）是植物对重力的定向生长反应，茎向上生长而根向下生长。在茎中，内皮层淀粉体（amyloplast）在重力感应细胞（statocyte）内沿重力方向沉降，触发Ca²⁺、质子及肌醇磷酸介导的信号传导，最终将生长素（auxin）重新定向至下侧并促进差异生长。因此，内皮层是茎中主要的重力感应组织。遗传学研究进一步支持这一作用：SCARECROW（SCR）和SHORT-ROOT（SHR）为正常内皮层发育所必需，scr和shr突变体破坏含淀粉体内皮层感应细胞层的形成，导致严重的茎向重力性缺陷。后续研究扩展了基于内皮层的模型，表明茎内皮层中液泡功能和SHOOT GRAVITROPISM（SGR）家族成员均为早期向重力性反应所必需。此外，多个核心向重力性调控因子优先在内皮层表达。其中，LAZY/LAZY1-LIKE蛋白将淀粉体沉降与PIN-FORMED（PIN）生长素转运蛋白的极性化联系起来，促进驱动定向生长的生长素梯度形成。C2H2型锌指转录因子SHOOT GRAVITROPISM 5（SGR5），亦称INDETERMINATE DOMAIN 15（IDD15），在茎向重力性中发挥重要作用。sgr5突变体表现出显著延迟的弯曲反应，且SGR5在茎内皮层细胞中高表达。然而，SGR5在茎向重力性过程中如何调控转录反应仍知之甚少。特别是重力感应内皮层细胞内的时序转录程序、相关基因及调控状态，以及这些程序在SGR5缺失后的改变程度，尚未完全阐明。由于植物茎由多种组织构成而重力感应集中于内皮层，批量RNA测序难以解析内皮层等小而关键细胞群的特异性转录反应。单核RNA测序（snRNA-seq）通过实现细胞分辨率转录组分析克服了这一局限。本研究利用时间分辨snRNA-seq构建了拟南芥花序茎早期向重力性反应的高分辨率转录组图谱，旨在定义重力刺激后内皮层转录状态和基因表达程序随时间的变化，鉴定与重力信号传导、生长素调控、细胞骨架组织和细胞壁重塑相关的基因及调控状态，并确定这些程序在SGR5缺失后如何改变。研究人员将snRNA-seq与GRN推断方法、SGR5 DNA亲和纯化测序（DAP-seq）分析及瞬时双荧光素酶报告基因实验相结合，以功能验证选定的启动子关系。研究人员提出一个工作模型，包含DAP-seq支持的基因型相关候选基因（包括LAZY1、SHOOT GRAVITROPISM 9（SGR9）和WAVE-DAMPENED 7（WDL7）），以及由候选枢纽KNOTTED-like from Arabidopsis thaliana 1（KNAT1）、BEL1-like homeodomain 1（BLH1）、BEL1-like homeodomain 2（BLH2）和CRY2-interacting bHLH 2（CIB2）标记的独特生长和细胞壁相关GRN状态。

研究背景方面，向重力性是植物对重力的定向生长反应，茎向上、根向下生长。茎中内皮层淀粉体沉降触发Ca²⁺、质子及肌醇磷酸信号，最终将生长素重新定向至下侧促进差异生长，内皮层因此是茎的主要重力感应组织。SCR和SHR为内皮层发育所必需，其突变破坏含淀粉体内皮层感应细胞层形成并导致严重向重力性缺陷。SGR家族成员和LAZY/IGT家族核心调控因子优先在内皮层表达。LAZY/LAZY1-LIKE蛋白将淀粉体沉降与PIN生长素转运蛋白极性化联系起来，近期研究还表明LAZY/LAZY1-LIKE蛋白招募RCC1样结构域（RLD）蛋白促进重力信号传导中PIN3的重新定位和极性生长素运输。此外，SUPPRESSOR OF LAZY QUADRUPLE 1（SLQ）的鉴定提示LAZY依赖和非依赖途径可能共同塑造茎向重力性。C2H2型锌指转录因子SGR5/IDD15在茎向重力性中发挥重要作用，sgr5突变体弯曲反应显著延迟，SGR5在茎内皮层细胞中高表达。水稻中SGR5/IDD15的功能同源基因LOOSE PLANT ARCHITECTURE1（LPA1）调控茎向重力性并影响分蘖角和叶角。尽管SGR5的重要性已确立，但其在茎向重力性中如何调控转录反应仍知之甚少。目前存在的问题包括：重力感应内皮层细胞内的时序转录程序、相关基因和调控状态，以及SGR5缺失后的改变程度尚未完全解析；SGR5相关转录反应是否涉及部分向重力性相关基因的启动子相关调控、内皮层转录和调控网络状态的更广泛重组，或二者兼有，仍待阐明。由于茎由多种组织构成而重力感应集中于内皮层，批量RNA测序难以解析内皮层等小而关键细胞群的特异性转录反应，内皮层特异性调控事件可能被群体水平数据掩盖。因此，研究人员利用时间分辨snRNA-seq构建了拟南芥花序茎早期向重力性反应的高分辨率转录组图谱，开展研究以定义重力刺激后内皮层转录状态和基因表达程序随时间的变化，鉴定相关基因和调控状态，并确定SGR5缺失后的改变。研究得出以下结论：SGR5缺失与重力、生长素和细胞骨架相关程序协调性降低相关；DAP-seq整合提名LAZY1、SGR9和WDL7为SGR5相关候选基因；双荧光素酶实验支持SGR5依赖性调控选定启动子；KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2标记独特的生长和细胞壁相关GRN状态。重要意义在于，本研究提供了内皮层分辨的转录框架以理解茎感应细胞中重力相关反应，并建立了在特定感应组织中解析刺激诱导调控程序的策略，为未来研究及潜在操纵作物器官构型提供了基础框架。

关键技术方法方面，研究人员采用时间分辨单核RNA测序（snRNA-seq），对拟南芥Col-0和sgr5突变体（idd15-5等位基因）花序茎在重力刺激后0、20、40和60 min进行转录组分析，每种基因型每个时间点三个生物学重复，每个重复汇集15株植物的茎段，共构建24个snRNA-seq文库。样本来源为拟南芥Col-0野生型及idd15-5（SALK_087765）和sgr5-1等位基因，idd15-5用于所有snRNA-seq实验。研究还采用基因调控网络推断（GENIE3和GRNBoost2）、SGR5 DAP-seq数据分析（GEO登录号GSE60143）及瞬时双荧光素酶报告基因实验（在Nicotiana benthamiana中进行）等功能验证方法，并结合Monocle3拟时序轨迹分析和拟时序分支占据分析。

研究结果方面，第一，时间分辨单核图谱捕获茎向重力性动态。研究人员首先量化了Col-0和两个sgr5等位基因（idd15-5和sgr5-1）在重力刺激后的茎向重力性弯曲，Col-0在180 min内逐渐向上弯曲，而两个sgr5等位基因均表现出显著受损和延迟的弯曲反应，证实了预期的茎向重力性缺陷表型。实时PCR显示SGR5在第一和第二茎节中表达最高，支持使用该区域进行转录组分析。研究人员对Col-0和sgr5茎在重力刺激后0、20、40和60 min进行时间分辨snRNA-seq，整合数据集解析出15个聚类代表七种主要细胞类型：表皮、内皮层、皮层、木质部、韧皮部、薄壁组织细胞和分生细胞。整合UMAP显示Col-0和sgr5之间细胞聚类大量重叠，整体聚类结构和聚类间边界基本保持，支持在匹配的注释细胞类型内进行比较分析。

第二，SGR5和核心向重力性调控因子在内皮层中优势富集。研究人员检测了SGR5缺失如何影响内皮层重力响应转录程序。在Col-0中，SGR5主要在内皮层细胞表达，重力刺激后从0到40 min增加，60 min下降但仍高于基线。其他SGR和LAZY家族成员显示类似的内皮层优势表达模式，提示向重力性相关基因集的协调表达。包括SGR1/SCR、SGR6、SGR7/SHR、SGR9、LAZY1、LAZY2、LAZY4和TAC1在内的多个核心基因在sgr5中整个时间进程普遍表达较低，部分基因在基线时差异已明显。在Col-0中这些基因在不同时间点达到最大表达，而sgr5中这种时序结构较不明显。读段覆盖分析显示sgr5中读段主要局限于T-DNA插入上游区域，而下游外显子覆盖强烈降低或缺失，因此表观信号主要反映截短的上游转录本而非完整全长SGR5 RNA。这些发现表明功能性SGR5缺失与茎内皮层中更广泛的SGR–LAZY向重力性相关基因集的时序协调性降低相关。

第三，内皮层特异性差异表达基因揭示SGR5相关向重力性转录程序。研究人员分析了注释内皮层群体内时间分辨差异基因表达和功能富集。Col-0和sgr5在0、20、40和60 min的直接比较揭示了向重力性、生长素和细胞壁相关基因表达的基因型相关差异。向重力性相关基因（包括LAZY1、LAZY2、TAC1、SGR6和SGR9）在Col-0中普遍高于sgr5，但差异幅度和时序模式因基因而异。生长素转运基因PIN3和细胞骨架相关基因WDL7同样在Col-0中持续较高表达，而ARF17和JACKDAW（JKD）表现出更明显的时间依赖性基因型相关差异。相反，细胞壁相关基因XTH33和EXLA1在sgr5中大部分时间进程表达较高。这些聚焦的谱图揭示了Col-0和sgr5之间重力、生长素、细胞骨架和细胞壁相关转录程序时序组织的基因特异性差异。在Col-0中，20 min反应包括茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）相关过程的富集，表明这些激素响应程序在重力刺激早期转录反应中被激活；40 min富集转向生长素转运和信号传导及细胞骨架相关通路；60 min反应扩展至乙烯和缺氧相关过程及额外生长相关程序。早期选定的细胞壁相关基因诱导先于40 min更强的生长素相关特征，可能代表准备性转录反应而非完成的差异生长。相比之下，sgr5中时序表达模式协调性较差，应激和缺氧相关特征保留，而向重力性、生长素和细胞骨架相关程序表现出较弱或改变的时序表达。功能富集进一步揭示sgr5中应激、代谢和淀粉相关过程代表性更高。研究人员将GO富集分析扩展至其他主要注释茎细胞类型，发现几个非内皮层群体也表现出Col-0和sgr5之间的时间依赖性差异，但受影响的过程因细胞类型而异。皮层和表皮显示伤口、茉莉酸、缺氧和应激相关反应的显著差异；薄壁组织显示生长素响应、光合作用、呼吸和缺氧相关过程的差异；韧皮部显示后期与缺氧和次生细胞壁组织相关的变化；木质部在20和40 min表现出木聚糖生物合成、多糖代谢和次生细胞壁生物发生的特别强富集。因此，基因型相关时序转录重编程并非仅限于内皮层，但重力、生长素和细胞骨架相关程序的组合在内皮层群体中组织最为清晰，而其他细胞类型主要显示组织特异性应激、代谢、光合和细胞壁相关反应。这些发现鉴定了内皮层中独特的、时序结构的向重力性相关程序，同时揭示了SGR5缺失在整个茎中更广泛的细胞类型特异性转录后果。

第四，SGR5缺失与内皮层细胞中应激和代谢相关转录状态相关。高分辨率重聚类鉴定出11个转录上不同的内皮层亚聚类。聚类特异性标记基因和GO富集模式用于为11个亚聚类分配简明功能转录状态注释。几个亚聚类显示基因型相关代表性差异。Col-0富集的聚类0和3显示与向重力性、生长素转运和细胞骨架组织相关的基因较高表达。聚类0以SGR6、SGR9、LAZY2、LAZY4、PIN3、PIN4和PIN7为特征，而聚类3显示候选调控因子KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2较高表达。因此，聚类0注释为重力/生长素/细胞骨架相关状态，聚类3注释为生长调控/细胞壁相关状态。相反，sgr5富集的聚类1和4分别主要以光合/光和应激相关或光合/ROS相关转录特征为特征。这些模式表明SGR5缺失与注释内皮层群体中重力和生长相关状态代表性降低以及应激和代谢相关状态代表性增加相关。这些差异是否直接源于SGR5相关调控改变或继发于受损的向重力性反应仍未解决。

第五，轨迹分析揭示SGR5相关的内皮层转录状态重组。研究人员进行了Monocle3拟时序分析作为按转录组相似性排序细胞核的补充框架。为避免仅将Col-0定义为参考起始状态，Col-0和sgr5的0 min内皮层细胞核共同用作基线根群体以定向共享轨迹。将拟时序值投影到共享UMAP上揭示了分支的内皮层转录状态景观。当两种基因型使用相同UMAP坐标分别显示时，Col-0和sgr5在共同学习的主图上显示出明显不同的分布。为直接确定这些差异是否反映基因型偏倚的分支占据，研究人员将主图分解为拓扑定义的图段并独立量化每个生物学重复中分配到各图段的细胞核比例。多个图段显示强烈的基因型相关占据差异。特别是图段08优先被Col-0细胞核占据，而图段12、14和15优先被sgr5细胞核占据（每个图段基因型FDR < 2 × 10^-12）。这些基因型相关差异在采样时间进程中广泛保持，这四个主要基因型偏倚图段未检测到显著的基因型×时间交互作用。重要的是，拟时序在两种基因型中均未随0、20、40和60 min采样序列单调增加，因此拟时序位置本身被解释为相对转录状态坐标而非流逝的生物学时间。分支特异性和拟时序分析表明，功能性SGR5缺失与共享内皮层转录状态景观中不同区域的基因型偏倚占据和重组相关，而非沿野生型轨迹的简单时间延迟。Monocle3 graph_test鉴定出263个表达与学习主图位置显著相关的基因。图相关基因集包括已确立的向重力性和生长素转运调控因子，包括LAZY1、LAZY2、TAC1、PIN3、PIN4、SGR6、GIL1、ASA1、WDL7和LAX3，表明已知重力和生长素相关组分嵌入推断的状态依赖性表达程序中。263个图相关基因的层次聚类解析出四个表达模式聚类，分别含88、87、62和26个基因。C1富集氧和缺氧响应过程及维管和细胞壁相关术语，C2以细胞周期、DNA修复和重组相关过程为主，C4主要与光合作用、电子传递、呼吸和能量代谢相关。值得注意的是，C3包含更广泛的激素和重力相关程序。除激素水平调控、糖基化合物代谢和硫代葡萄糖苷相关过程富集外，C3还包括多个已确立的向重力性和器官角度控制调控因子，包括GIL1、LAZY1、LAZY2/DRO3、TAC1和SGR6，以及生长素转运组分PIN3、PIN4、LAX3和ABCB19。C3还包含细胞骨架相关基因如WDL7、VLN1、SCAB2和EGR3，将重力和生长素相关转录状态与肌动蛋白和微管相关调控联系起来。这些基因水平注释表明C3程序包含协调的重力–生长素–细胞骨架相关转录特征。轨迹和功能分析表明功能性SGR5缺失与多个内皮层转录程序重组相关，包括重力–生长素–细胞骨架相关的C3程序，而非沿野生型轨迹的简单时间延迟。

第六，预测内皮层基因调控网络的基因型相关差异。研究人员从两种基因型在所有时间点推断了内皮层特异性GRN。由于这些网络从表达变异推断，转录因子–靶标关系被解释为预测调控关联而非直接相互作用。在GENIE3推断的网络中，KNAT1一致显示最高预测调控重要性，而BLH1、BLH2和CIB2反复位于最高排名调控因子之列。KNAT1、BLH1和BLH2属于TALE同源盒超家族，而CIB2是碱性螺旋–环–螺旋（bHLH）转录因子。在推断的内皮层网络中，这些候选枢纽显示与向重力性相关基因（包括SGR5、SGR6、LAZY1和LAZY4）的预测关联。SGR5本身显示相对中等的预测调控重要性。使用前400个GENIE3排名边比较匹配时间点Col-0和sgr5之间的预测连接性，在Col-0中保留在前400但不在相应sgr5网络中的边被操作性地分类为sgr5中丢失。在累积GENIE3比较中，KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2相关的高排名边在匹配的Col-0–sgr5比较中显示大量丢失，而检测到的SGR5相关边相对较少。这些结果表明sgr5中与这些候选枢纽相关的Col-0样预测调控架构保持减少。为检验这些候选枢纽的优先排序对网络推断算法选择的稳健性，研究人员使用GRNBoost2独立重建了所有八个条件特异性网络，使用与GENIE3相同的309基因输入集、41个候选转录因子和标准化表达矩阵。两种算法之间转录因子重要性排名在所有条件下强相关（Spearman's ρ = 0.816–0.911），每个条件下前10名调控因子中有6至9个共享。重要的是，尽管最高排名个体调控因子身份不同，KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2被两种算法反复优先排序。SGR5、KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2的前50预测靶标集在所有八个条件下也显示显著的跨算法重叠。为进一步确定KNAT1反复高GENIE3重要性是否可由随机网络组织解释，研究人员对所有八个条件特异性网络进行了靶标-wise调控因子标签置换分析。观察到的KNAT1总出边重要性在八个网络中范围为17.64至20.65，而随机均值约为7.53–7.54。在所有八个条件下，观察到的KNAT1重要性超过10,000次置换获得的所有值（每个条件经验P = 9.999 × 10^-5）。KNAT1在前400个GENIE3排名边中的连接性同样大于随机预期，观察到178–259个KNAT1相关边，而每个网络随机均值约为9.69–9.80个边。这些结果为KNAT1作为推断网络枢纽的反复优先排序提供了统计支持。表达分析进一步显示这些候选枢纽的高预测网络重要性并非简单归因于渐进转录诱导，KNAT1表达在Col-0基线时最高并在重力刺激后普遍下降，而在sgr5中显示较低或不同模式的表达。为表征与改变的KNAT1相关预测连接性相关的转录程序，研究人员检查了在Col-0中与KNAT1连接但在相应sgr5网络中未保留的基因，这些基因富集细胞壁多糖代谢、肽生物合成和糖基化合物相关过程。在Col-0中几个细胞壁相关基因显示时间依赖性诱导，而在sgr5中其激活较弱且普遍更接近基线。相反，应激相关基因在sgr5中选定时间点增加。因此，减少的KNAT1相关预测连接性与生长和细胞壁相关表达程序较弱代表性及应激相关模式较强代表性相一致。

第七，DAP-seq整合和报告基因实验支持SGR5相关启动子调控。为鉴定在内皮层相关、功能性SGR5缺失后表达降低且其定义启动子区域在体外显示SGR5结合潜力的基因，研究人员在整合snRNA-seq和公开SGR5 DAP-seq数据集之前应用了严格的细胞类型和方向特异性过滤策略。首先鉴定出988个相对于其他茎细胞类型在内皮层群体中富集的基因，独立地197个基因在sgr5内皮层中相对于Col-0在一个或多个匹配重力刺激时间点显著下调。这些基因集的交集产生116个在sgr5中表达降低的内皮层富集基因。将这116个基因的定义启动子区域与SGR5 DAP-seq峰交集，鉴定出39个启动子–峰重叠事件对应35个独特DAP-seq支持候选基因。尽管GENIE3和GRNBoost2反复优先排序KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2为高排名候选调控因子，这些因子未包含在35个DAP-seq支持候选基因中，支持将其解释为独特推断调控状态的组成部分而非启动子相关SGR5候选基因。对39个独特启动子重叠SGR5 DAP-seq峰区域的de novo基序分析鉴定出一个强富集序列基序（MEME E值 = 9.9 × 10^-40），与先前定义的SGR5及相关IDD家族DAP-seq基序相似。在严格过滤的候选中，SGR9、LAZY1和WDL7被保留，将候选集与已确立的向重力性相关过程联系起来。SGR9在重力感应中参与淀粉体–肌动蛋白相互作用，LAZY1参与重力诱导的生长素再分布，WDL7与细胞骨架组织相关。为功能检验选定启动子的SGR5依赖性调控，研究人员在Nicotiana benthamiana中使用WDL7、LAZY1和SGR9启动子构建体进行了瞬时双荧光素酶报告基因实验。与HA-pBA空载体对照相比，HA-SGR5共表达在六次独立实验中显著增强所有三个启动子的标准化FLUC/RLUC报告基因活性。几何平均倍数变化为WDL7 3.91、LAZY1 5.32和SGR9 3.65（双尾单样本比率t检验；P分别为0.0005、0.0008和0.0082）。这些结果表明SGR5正向调控测试的启动子报告基因活性。值得注意的是，WDL7、LAZY1和SGR9三个基因均保留在严格的DAP-seq支持、内皮层富集、sgr5下调候选基因中，为这些启动子的SGR5相关调控提供了互补证据。总之，这些分析提名35个内皮层富集、sgr5下调、DAP-seq支持候选基因。其中SGR9、LAZY1和WDL7提供了SGR5相关转录调控与淀粉体相关重力感应、生长素再分布和细胞骨架组织之间的候选联系。相反，KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2在两种推断算法中显示可重复的高预测调控重要性但缺乏可检测的SGR5 DAP-seq启动子关联，提示它们标记独特的生长和细胞壁相关网络状态。

讨论部分总结：本研究提供了茎向重力性早期转录反应的内皮层分辨视图，并鉴定SGR5/IDD15为与其时序协调相关的重要因子。通过整合时间分辨snRNA-seq、内皮层特异性差异表达、轨迹分析、GRN推断、SGR5 DAP-seq数据和瞬时双荧光素酶报告基因实验，研究人员发现功能性SGR5缺失不仅与单个重力响应基因的变化相关，而且与重力信号传导、生长素调控、细胞骨架组织和生长相关转录程序的更广泛重组相关。这些发现支持一个工作框架，其中SGR5相关转录反应包含两个相关但机制未解决的部分：DAP-seq支持的候选基因集与重力、生长素和细胞骨架过程相关，功能报告基因证据支持选定启动子的SGR5依赖性调控；以及由KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2标记的独特生长和细胞壁相关GRN状态。先前的遗传和生理学研究已确立SGR5为茎向重力性的重要调控因子，并显示sgr5突变体表现出延迟弯曲、改变的淀粉体沉降和花序茎中淀粉积累减少。尽管存在这些淀粉体相关缺陷，sgr5中向重力性和转录反应并未完全消除。几个重力响应基因仍对重力刺激有响应，尽管丰度和时序组织改变，提示额外的SGR5非依赖或平行重力响应机制可能仍活跃。在Col-0中，内皮层DEGs显示涉及重力、激素、细胞骨架和生长相关过程的时序结构变化，而sgr5显示生长素和向重力性相关反应协调较弱以及应激和代谢相关程序代表性增加。轨迹分析通过显示Col-0和sgr5细胞核占据共享转录状态景观但在不同主图段显示明显基因型偏倚占据强化了这一观点。分支特异性分析鉴定出Col-0富集和sgr5富集图区域，主要基因型相关差异在采样时间进程中广泛保持。这些发现反对sgr5沿其他方面不变的野生型轨迹延迟进展的简单解释。同时，由于两种基因型占据相同的共同学习主图并共享多个转录状态区域，数据未建立完全独立的突变体特异性发育谱系。相反，功能性SGR5缺失与共享状态景观内内皮层转录状态占据的重组相关。在该改变的转录景观中，DAP-seq支持的基因型相关候选集包括LAZY1、SGR9和WDL7，从而将SGR5相关转录变化与已知重力、生长素和细胞骨架相关过程联系起来。这些基因可置于茎向重力性已确立的生理序列中，其中内皮层感应细胞中的重力感知随后是生长素再分布和差异生长。在本数据集中，SGR/LAZY家族基因和ARF17与较早的重力和生长素相关转录反应相关，而WDL7和其他细胞骨架和生长相关基因与随后的转录变化相关。重要的是，双荧光素酶实验提供了SGR5正向调控选定启动子活性的功能证据。SGR5显著增强由WDL7、LAZY1和SGR9启动子驱动的报告基因活性，而这三个基因均独立受到严格DAP-seq和转录组整合的支持。这一区分对LAZY1尤为重要，其向重力性功能在蛋白质水平受到强烈控制。近期研究表明重力刺激诱导LAZY蛋白的MAPK依赖性磷酸化，促进蛋白质相互作用并驱动LAZY向低侧质膜重新定位。与DAP-seq支持的启动子关联一致，SGR5在双荧光素酶实验中显著增强LAZY1启动子报告基因活性，支持启动子水平的转录调控。然而，这种转录调控不同于控制LAZY1蛋白极性和活性的翻译后机制。更广泛地说，这里鉴定的转录反应可能与快速的蛋白质水平极性机制并行运作而非替代它们。这一解释也有助于将茎数据与根向重力性协调，其中淀粉体沉降、LAZY磷酸化和重新极化、PIN重新定位和生长素再分布可在实质性转录重编程之前发生。因此，在茎内皮层感应细胞中20–60 min检测到的转录程序可能代表伴随或跟随快速极性重力信号的互补调控层。本时间设计的一个局限是未采样重新定向后最初几分钟内发生的转录反应。SGR5相关转录框架的第二个特征是在生长和细胞壁相关GRN状态内反复鉴定KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2为候选枢纽。这些因子被GENIE3和GRNBoost2反复优先排序，其预测靶标集显示显著的跨算法重叠。对于KNAT1，靶标-wise调控因子标签置换分析进一步显示其推断网络重要性和前400连接性在所有八个条件特异性网络中显著大于随机调控因子分配下的预期。内皮层重聚类通过鉴定以KNAT1/BLH/CIB2相关表达为特征的Col-0富集转录状态提供了互补支持，而sgr5富集状态显示更强的应激、ROS、光合和代谢相关特征。总之，这些结果提示功能性SGR5缺失不仅与重力和生长素相关基因协调较弱相关，而且与更广泛的生长相关转录状态代表性降低相关。然而，在KNAT1、BLH1、BLH2或CIB2的定义启动子中未检测到SGR5 DAP-seq峰，且GRN算法从表达数据而非直接分子相互作用推断调控关系。因此这些因子应被视为计算支持的候选枢纽而非已验证的SGR5下游调控因子。TALE因子的反复优先排序可能与该GRN状态的生长相关特征具有生物学相关性，尽管数据未确立TALE蛋白独特地是向重力性生长所必需。KNAT1/BREVIPEDICELLUS已在花序架构、不对称生长和细胞分化中确立作用，并显示调控与木质素和细胞壁代谢相关的基因。KNOX和BEL1样同源域蛋白也可形成异源二聚体转录复合物，为发育程序的组合调控提供潜在基础。此外，KNAT1已在根偏斜中与生长素运输联系起来，而KNOX家族蛋白更广泛地与生长调控激素通路（包括细胞分裂素和赤霉素）交叉。机械响应性也已在STM（另一种I类KNOX因子）中得到证明，为KNOX转录调控与机械模式化生长之间的联系提供了家族水平先例。因此，KNAT1/BLH因子在预测枢纽中的富集与TALE蛋白在协调发育生长、激素相关调控和细胞壁相关过程中的已知作用一致，但未确立这些因子作为向重力性的独特或因果调控因子。本研究中未直接检查knat1、blh1或blh2突变体的茎向重力性表型，因此这些候选枢纽是否功能性参与花序茎向重力性仍需遗传分析确定。CIB2需要略有不同的解释，因为其在CRY2依赖性光周期开花中已确立作用。其在当前GRN中的反复优先排序可能反映更广泛的发育调控功能而非向重力性特异性作用。这与IDD15/SGR5本身与密切相关的IDD14和IDD16蛋白在开花时间调控中冗余参与特别相关。近期遗传分析显示idd14-1 idd15-5 idd16-1三突变体在长日条件下比野生型更早开花，而idd15-5单突变体在相同条件下开花时间与野生型无显著差异，表明这些IDD因子在开花时间控制中具有实质性功能冗余。因此，idd15-5无明显开花时间表型并不排除IDD15/SGR5的更广泛发育功能。该GRN状态的生长相关性质也与细胞壁相关基因的时序行为一致。这些基因的一个子集在20 min被诱导，先于40 min观察到的最强生长素转运和信号特征。这并非表明细胞壁重塑先于生长素再分布，而是可能反映后续组织变形的转录准备或重新定向后机械应变的早期响应。XTH33在此背景下特别有意义，因为其表达改变将SGR5相关转录变化与木葡聚糖重塑联系起来。然而由于未直接测量细胞壁结构、力学和木葡聚糖组织，这些转录差异的功能后果仍未解决。20 min时茉莉酸和水杨酸相关过程的短暂富集进一步提示早期重力刺激伴随更广泛的激素响应信号。虽然JA和SA经典上与应激和防御相关，但两种激素也与向重力性生长相关。在sgr5中应激、缺氧和代谢相关程序代表性增加可能反映改变的向重力性反应的继发后果而非独特的原发反应。本数据因此无法区分这些特征是直接源于SGR5缺失还是继发于受损的向重力性信号和生长。与其他解释一致，基因型相关时序重编程并非仅限于内皮层。然而，重力、生长素和细胞骨架相关程序的组合在内皮层群体中组织最为清晰。由于SGR5优先与茎内皮层功能相关，其他组织中的转录变化可能反映改变的生长素分布、机械反馈、细胞间信号传导或受损弯曲的继发后果而非SGR5缺失的直接细胞自主效应。总之，这些结果支持早期茎向重力性中SGR5相关转录组织的两部分工作模型。一个部分包含DAP-seq支持的基因型相关候选基因，与重力信号传导、生长素调控和细胞骨架组织相关，瞬时双荧光素酶实验为选定启动子的SGR5依赖性调控提供功能支持；第二部分包含由KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2标记的生长和细胞壁相关GRN状态。这些部分之间的关系仍未解决，可能是间接的、平行的或下游的。该框架而非定义线性调控级联，将SGR5置于更广泛的内皮层转录网络中，连接重力感知与持续的生长素相关信号、细胞骨架组织和生长相关转录程序。

研究结论部分翻译：本研究建立了早期茎向重力性的时间分辨单核转录组图谱，为内皮层感应细胞如何在重力感知后协调转录反应提供了见解。多组学整合支持一个两部分工作模型。第一部分包含DAP-seq支持的基因型相关候选基因，包括LAZY1、SGR9和WDL7，与重力信号传导、淀粉体–肌动蛋白动力学、生长素相关调控和细胞骨架组织相关。瞬时双荧光素酶实验进一步证明SGR5增强选定启动子的活性，包括WDL7、LAZY1和SGR9的启动子，为SGR5相关启动子调控提供功能支持。第二部分包含由KNAT1、BLH1、BLH2和CIB2标记的独特生长和细胞壁相关GRN状态。这两部分之间的关系仍未解决，可能是间接的、平行的或下游的。需要体内启动子占据、诱导型遗传扰动和遗传相互作用分析来确定这些候选基因和网络枢纽是否因果性参与茎向重力性。功能性SGR5缺失与重力和生长素相关转录程序协调性降低、重力和生长相关内皮层状态代表性降低以及应激和代谢相关状态代表性增加相关。这些发现提示内皮层转录状态组织的更广泛改变而非野生型反应的简单延迟。总体而言，本研究提供了内皮层分辨的转录框架以理解茎感应细胞中重力相关反应，并建立了在限定感应组织中解析刺激诱导调控程序的策略。这些发现为未来研究及潜在操纵作物器官构型的转化努力提供了基础框架。