《Journal of Chromatography Open》：Ambient-temperature ion-pairing reversed- phase chromatography for depletion of double-stranded RNA impurities from in-vitro transcribed RNA
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RNA类治疗药物近年来已被开发用于预防性疫苗、基因组编辑、蛋白替代治疗及细胞治疗等多种适应症。截至2025年1月，与mRNA类治疗药物相关的在研临床试验超过120项，其中针对传染病的mRNA临床试验占全部活跃临床试验的70%以上。随着RNA治疗领域的发展，自扩
RNA类治疗药物近年来已被开发用于预防性疫苗、基因组编辑、蛋白替代治疗及细胞治疗等多种适应症。截至2025年1月，与mRNA类治疗药物相关的在研临床试验超过120项，其中针对传染病的mRNA临床试验占全部活跃临床试验的70%以上。随着RNA治疗领域的发展，自扩增RNA（saRNA）与环状RNA（circRNA）等新型RNA治疗分子不断被探索。RNA疫苗及抗原类治疗药物通常采用体外转录（IVT）合成，一般使用噬菌体RNA聚合酶（常为T7 RNA聚合酶），配合线性化DNA模板与核苷三磷酸（NTPs），在含多种辅因子与添加剂的复杂缓冲体系中生成目标RNA。mRNA特异的5′帽可通过帽类似物在转录过程中加入，或在IVT反应后酶促添加。尽管IVT已被广泛研究并证明是可规模化的RNA生产方法，该过程仍会产生若干具有免疫刺激性的产品相关杂质，如短中止RNA片段和双链RNA（dsRNA）。RNA相关杂质随序列而异，常包括异质的RNA片段混合物及多种类型的dsRNA，例如run-off产物的3′延伸以及不同长度的反义RNA。这些多样化的杂质已被证明可激活模式识别受体，包括RIG-I、MDA5、Toll样受体TLR3以及蛋白激酶R（PKR），最终激活先天免疫系统，并抑制蛋白翻译，从而降低RNA治疗药物的效力。降低治疗性RNA原料药中dsRNA及其他杂质的两种常见策略包括：在IVT反应过程中尽量减少dsRNA的生成，以及在纯化过程中提高dsRNA的去除效率。在IVT反应中，使用修饰NTPs（例如m6-腺苷（m6A）、假尿苷（Ψ）和N1-甲基假尿苷（m1Ψ））替代以及其他技术，已被证明可降低总dsRNA含量，并随之降低RIG-I与PKR的激活；然而，对MDA5并未观察到相同效果。已有大量研究致力于理解IVT反应各参数对dsRNA生成的影响，包括时间、反应温度、反应物的质量与数量、反应物添加速率以及由目标抗原决定的DNA/RNA序列本身，Lenk等对此进行了系统综述。尽管上述部分努力或组合在减少IVT反应RNA杂质方面显示出前景，但这些方法无法普遍适用。例如，按Wesselhoeft等所述，采用PIE法合成circRNA时，100%取代的m1Ψ并不兼容，修饰NTP会消除环化效率；而通过控制RNA序列来减少杂质已被证明会削弱RNA作为治疗方式的平台兼容性，并会随着新疾病适应症的出现而需要大量优化。另一方面，已有研究评估色谱纯化方法用于去除与各类RNA模态相关的IVT杂质。具体而言，已有研究探索在变性条件下采用高效液相色谱（HPLC）离子对反相（IP-RP）从目标单链RNA（ssRNA）中分离dsRNA，以及疏水相互作用色谱（HIC）、阴离子交换（AEX）、纤维素纤维、酶消化、slalom色谱等方法的分离效果，成功程度不一。尽管这些方法在一定程度上能够将dsRNA与ssRNA分离，但在商业化实施方面仍面临障碍，包括可放大性有限、回收率低，以及在某些情况下需要升高温度才能实现最佳分离。为解决这些障碍，Kru?i?等近期描述了采用可放大的聚苯乙烯二乙烯基苯（SDVB）整体柱在室温下通过IP-RP去除dsRNA，用于纯化作为模型RNA的绿色荧光蛋白（GFP）RNA以及mCHiK(S27) saRNA分子。尽管结果令人鼓舞，但这些初步结果缺乏定量的dsRNA分析表征，仅限于单一色谱固定相，且未在评估中纳入多种治疗性RNA构建体。为建立与多样化治疗性RNA技术平台化生产兼容的dsRNA精纯步骤，本研究设定了三个目标：1）在分析型SDVB IP-RP柱上表征温度对dsRNA分离的影响；2）开发一种在常温下运行、能够降低具有不同dsRNA水平的多种mRNA疫苗构建体中dsRNA的IP-RP方法，并将该方法扩展至多种介质类型；3）证明可从circRNA的IVT产物中去除dsRNA。
研究背景方面，RNA类治疗药物已拓展至预防性疫苗、基因组编辑、蛋白替代治疗与细胞治疗等多个领域，saRNA与circRNA等新型分子不断涌现。IVT是RNA疫苗与抗原类治疗药物的常用合成方式，但该过程会同时产生短中止RNA片段与dsRNA等免疫刺激性杂质，这些杂质可激活RIG-I、MDA5、TLR3与PKR等模式识别受体，激活先天免疫并抑制蛋白翻译，降低疗效。现有降低dsRNA的策略存在明显局限：在IVT环节使用m6A、Ψ、m1Ψ等修饰NTPs虽可降低总dsRNA并减少RIG-I与PKR激活，但对MDA5无效；100%取代的m1Ψ与PIE法circRNA合成不兼容，会消除环化效率；通过控制序列减少杂质则削弱平台兼容性。在纯化环节，HPLC IP-RP（变性条件）、HIC、AEX、纤维素纤维、酶消化、slalom色谱等方法虽有一定分离能力，但存在可放大性有限、回收率低、部分需高温操作等商业化障碍。Kru?i?等虽报道了室温下SDVB整体柱IP-RP去除dsRNA，但缺乏定量dsRNA表征、仅限单一固定相、未覆盖多种治疗性RNA构建体。因此研究人员提出三个目标：表征温度对分析型SDVB IP-RP柱上dsRNA分离的影响；开发常温IP-RP方法以降低多种mRNA疫苗构建体的dsRNA并扩展至多种介质类型；证明可从circRNA的IVT产物中去除dsRNA。研究结论为：常温IP-RP色谱可在多种介质类型上实现dsRNA与ssRNA的分离，并成功应用于5种mRNA构建体及circRNA构建体，可分离circRNA疫苗候选物中的dsRNA与concatemers。其意义在于为多样化治疗性RNA技术提供了与平台化生产兼容的dsRNA精纯步骤。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员采用两种不同IVT反应条件制备5种聚腺苷酸化mRNA疫苗构建体（Sample 1A以UTP合成，Sample 1B及Samples 2–5以m1ΨTP合成），并以PIE法一锅IVT制备1种circRNA构建体（Sample 6）；IVT产物经CIMmultus? OligodT18整体柱纯化、50 kDa MWCO切向流过滤换液并无菌过滤。分析型RP-UPLC采用DNAPac RP柱在23°C、50°C、80°C下运行；制备型IP-RP在AKTA Pure 150上以0.1 M TEAA双缓冲液体系于常温运行，使用CIMmultus? SDVB整体柱与POROS? 20 R2填充柱。分析方法包括J2/K2抗体夹心ELISA定量残余dsRNA、毛细管电泳（CE）测定mRNA片段、E-Gel琼脂糖凝胶电泳测定RNA纯度，以及基于A260吸光度的色谱峰面积积分计算总RNA分布。
研究结果方面。Characterized temperature impact on dsRNA resolution in mRNA vaccine RP-HPLC：研究人员在分析型SDVB IP-RP柱上于23°C、50°C、80°C考察温度对dsRNA与ssRNA分离的影响，所用条件为4–20% MeCN梯度配合0.1 M TEAA，上样200 ng分离后的dsRNA与ssRNA样品并以A260监测，据此明确温度对dsRNA分辨率的作用。Developed ambient-temperature IP-RP chromatography across media types：研究人员建立常温（20–23°C）运行的制备型IP-RP方法，采用0.1 M TEAA、pH 7.0双缓冲液体系，上样前将RNA输入液调整为0.1 M TEAA与4% MeCN，0.5 mg稀释RNA以1 mL/min上样后流速升至2 mL/min，并在CIMmultus? SDVB整体柱与POROS? 20 R2填充柱等不同介质上实施；Condition 2将Mobile Phase B中MeCN由20%降至17%以改善dsRNA分辨，Condition 3针对circRNA纯化作进一步调整；各洗脱峰分段收集并经10 kDa MWCO浓缩换液，ELISA结果显示残余dsRNA降低。Applied ambient-temperature IP-RP chromatography to 5 mRNA constructs：该方法应用于5种mRNA疫苗构建体，起始dsRNA水平为0.3–4.9 ng-dsRNA/μg-RNA，涵盖UTP与m1ΨTP两种合成条件，ELISA定量显示各构建体dsRNA均获降低；CE用于评估全长转录本相对低分子量（LMW）片段的纯度。Separated dsRNA and concatemers in circular RNA vaccine candidates：针对circRNA构建体（起始dsRNA 0.7 ng-dsRNA/μg-RNA），研究人员调整方法条件后成功分离dsRNA与concatemers。此外，凝胶电泳用于RNA纯度评估，色谱峰面积积分用于计算各组分总RNA质量分布。
讨论部分总结：研究人员指出，ELISA法提供的是可操作的dsRNA估算值，而非对所有含双链杂质的绝对结构定量；该法经多项参数优化后，检测限（LOD）与定量限（LOQ）分别为0.01与0.04 ng dsRNA/μg RNA，低于LOQ的数值不用于计算定量倍数降低，此类样品以输入dsRNA浓度除以相应LOQ报告保守的倍数降低下限。基于OD260的RNA浓度估算假设核苷酸吸光度均一、无蛋白污染且不受二级结构或降解影响，但该方法存在局限，尤其对circRNA与dsRNA：消光系数随核苷酸组成略有变化，circRNA的共价闭合结构因缺少一个磷酸二酯键可能轻微影响浓度估算，且dsRNA的消光系数高于ssRNA。由于RNA材料有限，多数条件仅做一次重复，补充分子图2所示的三次重复运行色谱图相似，但未对所有构建体或条件进行重现性考察。研究结论翻译：常温离子对反相色谱可用于去除体外转录RNA中的双链RNA杂质；研究人员表征了温度对mRNA疫苗RP-HPLC中dsRNA分辨率的影响，开发了跨介质类型的常温IP-RP色谱方法，将其应用于5种mRNA构建体，并在circRNA疫苗候选物中实现了dsRNA与concatemers的分离。
