全氟丁酸诱导人肺成纤维细胞早衰伴随RNA m1A调控因子改变与蛋白质组重塑

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Perfluorobutyric acid induces premature senescence in human lung fibroblasts with altered RNA m1A regulators and proteomic remodeling

全氟丁酸（PFBA）改变了G2/M期分布、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性、活性氧（ROS）水平以及衰老相关分泌表型（SASP）相关基因的表达。PFBA改变了m1A相关调控因子的信使核糖核酸（mRNA）和蛋白水平。蛋白质组学分析揭示了PFBA暴露后细胞蛋白谱的广泛变化。PFBA改变了TRMT61B相关的转录本回收，包括白细胞介素6（IL6）、叉头框蛋白O1（FOXO1）和线粒体转录因子A（TFAM）。

论文解读文章

研究背景与科学问题

随着全球人口老龄化加速，阐明衰老及年龄相关疾病的分子机制成为生命科学与医学领域的核心挑战。细胞衰老是一种关键的细胞过程，其特征为稳定的细胞周期停滞、功能改变、衰老相关分泌表型（SASP）激活以及多种生物标志物的表达。环境暴露可通过氧化应激、表观遗传修饰和线粒体功能障碍触发细胞衰老。

全氟丁酸（PFBA）作为长链全氟和多氟烷基物质（PFAS）的短链替代品，在环境中持续存在。已有报道指出PFBA可干扰细胞周期进程和代谢稳态，并诱导氧化应激、细胞毒性及内分泌或发育效应。尽管PFBA的生物累积潜力低于长链化合物，但其显著细胞毒性及对细胞周期的影响提示其可能诱导早衰。此外，RNA N1-甲基腺苷（m1A）是一种重要的RNA修饰，参与转录后调控和多种细胞过程。然而，PFBA暴露、衰老相关细胞反应与RNA修饰因子表达之间的关系尚不清楚。本研究旨在探讨重复PFBA暴露是否诱导人肺成纤维细胞（HLF）发生早衰，并观察伴随的m1A调控因子、蛋白质组学及TRMT61B与其靶RNA结合能力的变化，为理解外源污染物诱导早衰的机制提供科学依据。

研究方法概述

研究人员采用体外细胞实验模型，以男性胎儿来源的人胚肺成纤维细胞（HLF，购自中国科学院基础医学研究所）为研究对象。主要关键技术方法包括：细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法评估细胞活力；衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测衰老标志物；流式细胞术分析细胞周期分布和细胞内活性氧（ROS）水平；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测mRNA表达水平；蛋白免疫印迹（Western blot）检测蛋白水平；基于数据非依赖性采集（DIA）的蛋白质组学技术进行差异表达蛋白（DEP）鉴定与分析，并结合基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因集富集分析（GSEA）及蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络进行生物信息学分析；RNA免疫沉淀联合定量PCR（RIP-qPCR）评估候选转录本在TRMT61B免疫沉淀物中的回收情况。

主要研究结果

3.1 短期重复PFBA暴露诱导早衰表型

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  细胞活力影响：24小时PFBA处理呈剂量依赖性抑制细胞活力，IC₅₀为(712.0 ± 88.8) μmol/L。后续实验选用40.0、178.0和356.0 μmol/L三个浓度连续暴露7天。
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  SA-β-gal活性变化：所有PFBA处理组SA-β-gal阳性细胞比例均显著高于对照组（P < 0.001），高剂量组（H-PFBA）达89.7%，与阳性对照H₂O₂组无显著差异。
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  细胞周期分布：与对照组相比，各处理组G0/G1期细胞比例显著下降，而G2/M期细胞比例显著增加（P < 0.05），表明PFBA导致G2/M期阻滞。
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  ROS水平改变：各PFBA处理组细胞内ROS相关荧光强度均显著升高（P < 0.01），其中H-PFBA组升高最为明显，较对照组增加约2.1倍。
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  SASP转录本表达：H-PFBA组IL6 mRNA表达上调3.4倍；MMP1在各PFBA组均显著上调，H-PFBA组达对照组的3.6倍；TNF-α在低剂量组（L-PFBA）上调3.1倍。

3.2 PFBA暴露后RNA m1A相关调控因子表达变化

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  mRNA水平：m1A甲基转移酶TRMT6和TRMT10C的mRNA在L-PFBA组显著升高，但在中、高剂量组显著降低；而TRMT61B的mRNA在所有PFBA组均一致显著升高（最高达对照7.7倍）。去甲基化酶ALKBH3的mRNA在L-PFBA组升高，在中剂量组（M-PFBA）降低。m1A结合蛋白YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的mRNA在中、高剂量组均显著下调。
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  蛋白水平：TRMT6蛋白在L-PFBA和M-PFBA组显著升高，在H-PFBA和H₂O₂组降低；TRMT10C和TRMT61B蛋白在H-PFBA和H₂O₂组显著升高。ALKBH3蛋白在各处理组均显著下调。YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3蛋白在所有PFBA处理组均一致下调。

3.3 PFBA暴露引发的蛋白质组改变

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  蛋白鉴定与功能注释：共鉴定并定量6215种蛋白。DEPs显著富集于氧化还原过程、蛋白磷酸化、蛋白结合及ATP结合等功能类别，以及核糖体、氧化磷酸化和坏死性凋亡等KEGG通路。
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  差异蛋白分析：PFBA组与对照组比较，鉴定出1190个DEPs（445个上调，745个下调）。GSEA分析显示，PFBA组相对于对照组，细胞外区域、氧化磷酸化等基因集呈正富集，而DNA结合、RNA识别基序等呈负富集。
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  亚细胞定位与结构域：PFBA诱导的差异蛋白主要分布于细胞核（35.8%）、细胞膜（15.6%）和线粒体（12.2%）。显著富集的结构域包括WD40重复序列、AAA+ ATP酶结构域和胶原三螺旋重复序列。
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  蛋白互作网络：PPI分析筛选出IL6、FOXO1和TFAM作为候选网络相关蛋白用于进一步验证。

3.4 候选转录本在TRMT61B免疫沉淀物中的表达与回收

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  转录本表达：与对照组相比，H-PFBA组IL6 mRNA表达升高3.4倍，而FOXO1和TFAM的mRNA分别降至对照组的25.6%和38.2%。
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  RIP-qPCR回收：在TRMT61B免疫沉淀物中检测到IL6、FOXO1和TFAM的扩增产物。PFBA处理后，FOXO1的回收率显著增至对照组的6.1倍。相关性分析显示，在对照组与PFBA组中，IL6和FOXO1的mRNA表达水平与其在TRMT61B免疫沉淀物中的回收率呈负相关，而TFAM呈正相关。

讨论总结与研究结论

讨论总结：本研究证实重复PFBA暴露与HLF的衰老相关表型相关联，表现为SA-β-gal阳性率增加、G2/M期阻滞、ROS升高及SASP相关转录本表达上调。蛋白质组学分析还发现p21^CIP1丰度显著增加和核纤层蛋白B1（Lamin B1）丰度降低，符合常用衰老标志物特征。需注意的是，这些发现应综合解读为支持衰老相关表型，而非独立证明不可逆衰老。所采用的PFBA名义浓度远高于一般人群血清检测浓度，因此结果仅反映特定体外条件下的细胞反应，不应直接推断为人体健康风险。

m1A相关调控因子（甲基转移酶TRMT6、TRMT10C、TRMT61B，去甲基化酶ALKBH3及候选RNA结合蛋白）的表达变化提示PFBA暴露伴随调控环境的重塑，但mRNA和蛋白表达测量不能直接量化全局m1A丰度。蛋白质组分析揭示PFBA与H₂O₂诱导的富集模式存在差异，涉及氧化磷酸化、PI3K-Akt信号及细胞外基质（ECM）-受体相互作用通路。RIP-qPCR结果显示IL6、FOXO1和TFAM转录本在TRMT61B免疫沉淀物中的回收存在处理相关差异，但这不构成直接的RNA-蛋白结合或转录本特异性m1A修饰的证据。

研究结论：本研究表明，持续性全氟丁酸（PFBA）暴露在人肺成纤维细胞中诱导了显著的衰老相关改变，特征为SA-β-gal阳性率增加、G2/M期细胞周期积累、细胞内ROS水平升高以及SASP相关基因表达改变。这些表型变化伴随着RNA m1A调控系统的实质性改变，包括甲基转移酶、去甲基化酶ALKBH3和YTH家族结合蛋白的差异表达，突出了RNA修饰相关调控在PFBA相关细胞反应中的潜在参与。此外，定量蛋白质组学分析揭示了广泛的蛋白表达谱变化，差异蛋白富集于氧化磷酸化、细胞周期调控和凋亡等生物学过程，提示PFBA暴露、细胞应激反应和代谢改变之间的潜在联系。值得注意的是，衰老相关候选基因IL6、FOXO1和TFAM表达的改变及其在TRMT61B免疫沉淀物中的差异性回收，将TRMT61B相关的RNA调控确定为有前景的进一步机制研究方向。总体而言，这些发现提供了PFBA诱导的衰老相关细胞与分子反应的整合性表征，并强调了RNA m1A调控因子和蛋白质组重塑与短链PFAS暴露生物学效应的潜在关联。本研究拓展了对PFBA细胞毒性的认识，并为未来机制研究和短链PFAS替代品的综合毒理学评价提供了有价值的实验证据和候选分子靶点。