《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：LncRNA CPS1-IT1 attenuates radiation resistance by inhibiting MAPK7 expression via stabling stromal cell-derived miR-125b-5p in non-small-cell lung cancer
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非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的恶性肿瘤之一，其生存率仍然较低。除手术外，放射治疗是早期NSCLC的确定性治疗选择，但由于放射抵抗，治疗效果不佳。放射抵抗性NSCLC细胞如何被保护免受辐射的机制尚不清楚。本研究旨在探讨非编码RNA如何影响信号通路以赋予放射
非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的恶性肿瘤之一，其生存率仍然较低。除手术外，放射治疗是早期NSCLC的确定性治疗选择，但由于放射抵抗，治疗效果不佳。放射抵抗性NSCLC细胞如何被保护免受辐射的机制尚不清楚。本研究旨在探讨非编码RNA如何影响信号通路以赋予放射抵抗性NSCLC细胞对抗放射治疗的保护作用。研究人员建立了稳定表达长链非编码RNA（lncRNA）氨甲酰磷酸合成酶1内含子转录本1（CPS1-IT1）或微小RNA（miRNA）miR-125b-5p的NSCLC细胞。此外，采用RNA纯化分离染色质（ChIRP）技术鉴定lncRNA-DNA相互作用。同时，通过RNA反义纯化（RAP）检测RNA-蛋白质相互作用。本研究表明，CPS1-IT1或miR-125b-5p过表达在体外和体内均使放射抵抗性NSCLC细胞对放射治疗敏感。在机制上，CPS1-IT1通过与EZH2和NOP58相互作用增强MAPK7基因启动子处的组蛋白甲基化，从而抑制丝裂原活化蛋白激酶7（MAPK7）的转录。此外，CPS1-IT1稳定的来源于NSCLC细胞中基质细胞的miR-125b-5p也通过TRAF6-EZH2-MAPK7通路减弱放射抵抗。综上所述，这些发现表明CPS1-IT1通过NOP58/EZH2轴抑制MAPK7表达，并经稳定基质细胞来源的miR-125b-5p减弱NSCLC的放射抵抗，值得进一步的临床前评估作为调节NSCLC放射反应的候选策略。
研究背景：肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，约占所有癌症死亡人数的20%。根据组织学分类，85%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC），5年生存率从IA期的77%到IV期的1-2%不等。对于早期NSCLC，手术切除仍是可手术患者首选的治疗方式，而放射治疗是不可手术或拒绝手术患者的确定性治疗选择。然而，放射抵抗经常发生并导致治疗失败。Calu-3细胞系是公认的放射抵抗性NSCLC细胞系，但这些细胞如何被保护免受辐射的机制尚不清楚。DNA损伤修复、缺氧、细胞周期再分布、干性和肿瘤微环境效应是公认的放射生物学决定因素，但非编码RNA在放射抵抗中的作用仍不明确。长链非编码RNA（lncRNA）参与众多生物学过程的细胞信号通路，包括癌症的放射抵抗。CPS1-IT1是一种新型抑癌lncRNA，可抑制NSCLC生长和转移，但其在NSCLC放射抵抗中的作用知之甚少。既往研究报道MAPK7在NSCLC中上调并通过促进DNA损伤反应赋予放射抵抗。此外，miR-125b-5p对NSCLC具有抗癌作用，但其在NSCLC放射抵抗中的作用在很大程度上未知。来源于基质细胞的小细胞外囊泡（sEVs）可调节乳腺癌的放射抵抗，且NSCLC患者血清sEVs中miR-125b-5p水平下调。因此，本研究旨在探讨lncRNA CPS1-IT1和来源于基质细胞的miR-125b-5p是否影响Calu-3细胞的放射抵抗及其作用机制。
主要技术方法：研究人员建立了稳定表达CPS1-IT1或miR-125b-5p的Calu-3细胞系；采用ChIRP鉴定lncRNA-DNA相互作用；采用RAP检测RNA-蛋白质相互作用；采用染色质免疫沉淀（ChIP）检测启动子区蛋白结合和组蛋白甲基化；采用双荧光素酶报告基因实验检测启动子活性和miRNA靶向结合；采用miRNA pulldown检测miRNA-lncRNA相互作用；采用RNA衰减实验检测miRNA半衰期；采用CCK-8和流式细胞术检测细胞活力和凋亡；采用Hs5人基质细胞来源的sEVs进行共培养实验；采用裸鼠移植瘤模型进行体内验证。细胞系来源于中国科学院细胞库，并经STR鉴定。
研究结果：
3.1 CPS1-IT1降低Calu-3细胞的放射抵抗：CPS1-IT1在Calu-3细胞中的表达显著低于BEAS-2B正常支气管上皮细胞及既往报道的对放射非抵抗的NSCLC细胞系（H460、H23和H1299）。过表达CPS1-IT1呈剂量依赖性降低Calu-3细胞经照射后的细胞活力，并在6 Gy照射后48 h诱导显著更高的凋亡水平，表明CPS1-IT1使细胞对放射诱导的凋亡敏感。
3.2 CPS1-IT1抑制Calu-3细胞中MAPK7转录：过表达CPS1-IT1降低Calu-3细胞中MAPK7的mRNA和蛋白水平，双荧光素酶报告基因实验证明过表达CPS1-IT1降低MAPK7启动子活性，表明CPS1-IT1通过抑制转录来抑制MAPK7表达。
3.3 CPS1-IT1通过NOP58将EZH2募集至MAPK7启动子：ChIRP结果显示CPS1-IT1探针在MAPK7启动子处富集。RAP鉴定出CPS1-IT1与NOP58和EZH2蛋白结合。敲低NOP58可破坏CPS1-IT1与EZH2蛋白的结合。ChIP证实NOP58和EZH2均结合于MAPK7启动子，而敲低CPS1-IT1可消除这种结合，支持CPS1-IT1相关的NOP58/EZH2复合物存在于MAPK7启动子处。
3.4 CPS1-IT1通过NOP58经EZH2增强MAPK7启动子组蛋白甲基化抑制MAPK7转录：敲低NOP58或EZH2均增加Calu-3细胞中MAPK7 mRNA水平及启动子转录活性。ChIP显示MAPK7启动子处存在H3K27me3修饰，而敲低CPS1-IT1可消除该修饰，表明CPS1-IT1通过NOP58募集的EZH2活性增强启动子组蛋白甲基化来抑制MAPK7转录。
3.5 CPS1-IT1通过NOP58和EZH2降低Calu-3细胞的放射抵抗：过表达CPS1-IT1降低细胞活力并诱导更高水平凋亡，而敲低NOP58或EZH2可逆转此效应，表明CPS1-IT1通过与NOP58和EZH2相互作用控制细胞对放射诱导凋亡的敏感性。
3.6 基质细胞来源的miR-125b-5p减弱Calu-3细胞的放射抵抗：成功分离Hs5基质细胞来源的30-150 nm sEVs，表达CD63和CD81标志物，可被Calu-3细胞摄取并递送miR-125b-5p。Hs5细胞经6 Gy照射后来源的sEVs中miR-125b-5p水平显著降低。Hs5来源sEVs降低照射后Calu-3细胞活力并诱导凋亡，而miR-125b-5p抑制剂可逆转此效应，表明基质细胞来源的miR-125b-5p参与Calu-3细胞放射抵抗机制。
3.7 基质细胞来源的miR-125b-5p通过TRAF6增加EZH2以减少MAPK7：过表达TRAF6降低Calu-3细胞中EZH2蛋白水平。在TRAF6 mRNA 3‘UTR鉴定出推定的miR-125b-5p结合位点，稳定表达miR-125b-5p降低TRAF6 mRNA水平及TRAF6报告基因活性，突变结合位点可消除此效应。稳定表达miR-125b-5p降低MAPK7表达，表明miR-125b-5p通过TRAF6增强EZH2表达以减少MAPK7。
3.8 CPS1-IT1提高Calu-3细胞中miR-125b-5p稳定性：miR-125b-5p在Calu-3细胞中低于BEAS-2B及放射非抵抗NSCLC细胞系。miRNA pulldown证实miR-125b-5p与CPS1-IT1相互作用。过表达CPS1-IT1升高miR-125b-5p水平，RNA衰减实验显示CPS1-IT1过表达将miR-125b-5p的半衰期从1.26 h延长至2.60 h，表明CPS1-IT1增加miR-125b-5p稳定性。
3.9 CPS1-IT1和miR-125b-5p在体内减弱Calu-3细胞放射抵抗：在裸鼠移植瘤模型中，放射不能减小对照Calu-3细胞形成的肿瘤大小和重量，而过表达CPS1-IT1或miR-125b-5p在放射后显著减小肿瘤大小和重量，表明CPS1-IT1和miR-125b-5p水平可改变细胞在体内对放射诱导细胞死亡的敏感性。
讨论部分总结：本研究首次报道lncRNA CPS1-IT1和基质细胞来源的miR-125b-5p可在体外和体内改变Calu-3细胞的放射抵抗。机制上，CPS1-IT1通过与NOP58结合，将EZH2募集至MAPK7启动子，增强组蛋白甲基化抑制MAPK7转录；同时，CPS1-IT1稳定基质细胞来源的miR-125b-5p，后者通过抑制TRAF6（TRAF6促进EZH2泛素化降解）增加EZH2表达，进而降低MAPK7。两条通路汇聚于MAPK7调控以改变放射敏感性。研究首次报道CPS1-IT1参与放射抵抗，首次报道NOP58作为CPS1-IT1/EZH2复合物的支架参与组蛋白甲基化（区别于其经典snoRNP功能），首次揭示miR-125b-5p通过抑制TRAF6增强EZH2表达，并扩展了lncRNA调控miRNA稳定性的认识。研究也指出局限性：需要克隆形成存活实验确认内在放射抵抗；Hs5细胞来源sEVs中miR-125b-5p经照射后降低的机制尚不清楚；MAPK7下游信号通路有待鉴定；CPS1-IT1提高miR-125b-5p稳定性的机制需进一步阐明；未来需在同基因获得性放射抵抗模型、多种NSCLC分子亚型及患者来源类器官或移植瘤系统中验证这些机制是否可推广至Calu-3细胞之外。任何对CPS1-IT1或miR-125b-5p的治疗性操作均需肿瘤选择性递送并正式评估正常肺组织放射敏感性。
研究结论翻译：总之，本研究表明CPS1-IT1通过NOP58经EZH2增强MAPK7启动子组蛋白甲基化，抑制MAPK7转录，从而减弱NSCLC细胞的放射抵抗。此外，CPS1-IT1稳定的来源于NSCLC细胞中基质细胞的miR-125b-5p通过TRAF6增加EZH2以减少MAPK7，从而改善放射抵抗。这些数据首次揭示了CPS1-IT1/NOP58/EZH2轴和基质细胞来源的miR-125b-5p在调控MAPK7影响NSCLC细胞放射抵抗中的作用，为癌细胞如何抵抗放射治疗的机制提供了见解，并确定了对抗放射抵抗的潜在靶点。
