《Aquaculture, Fish and Fisheries》：Short-Term Effect of Fishmeal-Free Feed Formulation on Growth Performance, Feed Efficiency and Transcriptomic Profile of Hypothalamus and Liver in Atlantic Salmon
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大西洋鲑（Salmo salar）养殖业日益寻求海洋来源原料的替代方案，但鱼粉（FM）替代的生理与分子后果仍未被完全理解。本研究评估了两种营养等效的夏季饲料在模拟塔斯马尼亚夏季条件（18°C）下对大西洋鲑的影响：含鱼粉饲料（FM）与无鱼粉饲料（FMF）。研究评
大西洋鲑（Salmo salar）养殖业日益寻求海洋来源原料的替代方案，但鱼粉（FM）替代的生理与分子后果仍未被完全理解。本研究评估了两种营养等效的夏季饲料在模拟塔斯马尼亚夏季条件（18°C）下对大西洋鲑的影响：含鱼粉饲料（FM）与无鱼粉饲料（FMF）。研究评估了生长性能、饲料效率以及下丘脑和肝脏的转录组响应，以评价鱼粉替代的影响。40天后，FM组显示出显著更高的终末体重和肥满度。转录组呈现饲料特异性响应。与FMF组相比，FM组鱼下丘脑中小型神经肽黑色素聚集激素（MCH）活性及脂肪酸营养感知相关基因显著上调，提示对摄食和能量调节的促进作用。在肝脏中，FM处理诱导了显著的脂质激活、信号传导和重塑通路，表明必需脂肪酸可利用性更高。FMF处理显著上调了涉及肝脏从头脂肪合成的基因，暗示脂肪酸供应有限。本研究鉴定了饲料依赖的下丘脑基因表达模式，与摄食调节改变相一致，尤其在MCH通路内，同时FMF组鱼表现出代偿性肝脏脂肪合成响应。这些转录组发现推进了研究人员对夏季温度条件下大西洋鲑完全鱼粉替代分子后果的理解。
**研究背景与问题**
大西洋鲑是全球贸易价值最高的养殖鳍鱼物种，约占全球贸易总值的20%。传统养殖区域位于北半球（挪威、英国、加拿大），但产业已扩展至南半球，塔斯马尼亚凭借其有利的沿海结构和相对温暖的海水温度成为关键枢纽。气候变化正驱动塔斯马尼亚周边海表温度快速上升，海洋热浪期间温度可超过大西洋鲑最适范围，达到23°C。高温常伴随溶解氧降低，诱导应激反应，导致摄食量（FI）下降、性能降低和产品品质受影响。与此同时，水产养殖业因可持续性关切而寻求减少对鱼粉（FM）和鱼油的依赖，植物源原料和动物副产物等替代蛋白源已被广泛探索，但其对摄食、营养生物利用度和鱼类生理的影响仍不一致，存在抗营养因子、消化率降低和组织品质改变等挑战。在鲑科鱼类中，家禽副产物蛋白粉替代鱼粉已有广泛测试但结果不一。值得注意的是，塔斯马尼亚大西洋鲑在夏季高温期间饲喂仅含6%鱼粉（主要用家禽粉替代）的饲料可维持关键生产指标和心脏健康，提示低鱼粉含量在次优环境条件下可行。鉴于这些响应，需要进一步研究完全鱼粉替代的影响，特别是通过组学方法识别驱动性能和产品品质变化的分子与生理机制。研究人员假设鱼粉去除会降低摄食量和生长性能，并伴随下丘脑食欲调节通路和肝脏脂质与氨基酸代谢的可检测转录组差异。
**研究内容与结论**
本研究首次在模拟塔斯马尼亚夏季条件（18°C）下同时分析大西洋鲑下丘脑和肝脏对完全鱼粉替代的转录组响应，在单一试验中整合中枢食欲调节和外周代谢信号。研究人员对投喂商业配方FMF饲料或传统FM饲料的入海后大西洋鲑（>1.9 kg）进行了比较转录组全分析。FMF配方以家禽粉为主要蛋白源，设计为满足所有最低必需氨基酸需求且等能量。鱼在模拟温和塔斯马尼亚夏季条件（18°C，90%–100%溶解氧）下养殖32天（经8天驯化）。采集下丘脑和肝脏组织进行转录组分析，采用RNA-seq技术评估差异基因表达，通过生物信息学分析鉴定与蛋白质和脂质代谢、营养感知及摄食调节相关的富集通路。研究结论为：在模拟塔斯马尼亚夏季条件下，用家禽粉完全替代鱼粉显著降低了大西洋鲑的终末体重和肥满度，摄食量、饲料效率和特定生长率虽一致偏低但未达统计学显著。鉴于试验持续时间短和初始鱼体较大，这些性能差异为指示性而非确定性，转录组响应提供了更清晰的信号。鱼粉添加与肝脏脂质重塑和蛋白稳态能力一致的转录模式相关，同时下丘脑MCH和营养感知通路富集。鱼粉去除则倾向于肝脏从头脂肪合成和糖酵解，下丘脑谱偏向维持和应激相关转录本，即从底物周转向生物合成和稳态维持的转变，这与其他硬骨鱼摄食蛋白替代饲料后的响应一致。所得候选转录本面板值得在未来试验中作为膳食鱼粉状态的指标进行评估。解释仍受限于缺乏qPCR验证和膳食诱食剂定量，后者妨碍了将摄食差异单独归因于中枢食欲调节。
**关键技术方法**
研究使用两种等氮等脂实验饲料（39%粗蛋白、35%粗脂），FM饲料含12%鱼粉，FMF饲料以家禽粉（20%）为主要蛋白源完全替代鱼粉，鱼油从8%增至10%以维持必需脂肪酸供应。实验鱼为Huon Aquaculture提供的全雌入海后大西洋鲑，在海水循环水养殖系统（RAS）中预驯养约7个月后，选取186尾（1936 ± 18.9 g）分配至6个7000-L实验桶（每处理3桶），经5天驯化后以1°C/天升温至18.0°C ± 0.01°C，维持40天（含驯化期），光周期14L:10D，溶解氧94.6% ± 0.03%。采样在预期首次投喂后2小时内进行，每桶取2尾（每处理n = 6）采集肝脏后部约25 mg和下丘脑区域组织，RNA完整性数值（RIN）≥ 9.4。共构建24个RNA-Seq文库（2组织×12生物学重复），使用Illumina NovaSeq 6000平台测序，每个组织约3500万条150-bp双端读长。高质量读长映射至大西洋鲑基因组Ssal_v3.1，使用Kallisto进行映射，edgeR和limma/voom进行差异表达分析（FDR ≤ 0.05，log2倍数变化 ≥ 0.33用于显著性判定；log2 ≥ |2|用于鉴定感兴趣基因）。使用ShinyGo v0.81进行GO和KEGG富集分析，REVIGO减少GO术语冗余。统计采用嵌套方差分析（ANOVA），以桶为随机因子嵌套于饲料处理内，桶水平参数使用Wilcoxon秩和检验。
**研究结果**
**生产生物学指标**：存活率高且各处理一致（98.9%），无显著差异。FM处理终末体重（2615 ± 38 g vs. 2484 ± 42 g，p = 0.02）和肥满度K（1.95 ± 0.01 vs. 1.90 ± 0.02，p = 0.03）显著高于FMF处理。体重增加、特定生长率（SGR）、摄食量、饲料效率、饲料转化率（FCR）、屠宰出肉率、内脏体指数和器官体指数（HSI、CSI、SSI）均无显著差异。FM处理FCR数值较低（0.90 ± 0.01 vs. 0.97 ± 0.03），SGR数值较高（0.75% ± 0.01% vs. 0.62% ± 0.04%），但均未达统计学显著。FM处理代谢体重摄食量（FI MBW）在第5天后持续数值上高于FMF处理，平均高出超过1 g/kg MBW/天（p = 0.10）。摄食量轨迹在实验第8天温度达到18°C后不久出现下降。
**转录组对饲料处理的响应**：肝脏中检测到532个差异表达转录本（DETs），其中221个在FM处理中上调，311个在FMF处理中上调。下丘脑中鉴定到578个DETs，其中323个在FM处理中上调，255个在FMF处理中上调。KEGG富集分析显示，肝脏中脂肪酸生物合成、细胞周期和MAPK信号通路在FMF处理中富集，而凋亡在FM中富集。下丘脑中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路在FM处理中显著富集。GO富集分析显示，肝脏中FM上调DETs富集20个分子功能GO术语，FMF上调DETs富集20个分子功能GO术语；FM上调DETs富集10个生物学过程GO术语，FMF上调DETs富集17个生物学过程GO术语。下丘脑中FM上调DETs富集20个分子功能GO术语和20个生物学过程GO术语，FMF上调DETs仅富集4个分子功能GO术语，无富集的生物学过程GO术语。
**肝脏营养响应功能类别**：FM组鱼脂质动员和能量代谢相关基因上调，包括acsl3b（脂肪酸激活）、dgkza（脂质信号）、abhd5（脂质分解）、agps（醚脂合成）和ampd3b（能量代谢）表达显著升高。FMF组鱼表现出去头脂肪合成（fasn）、甘油三酯合成（dgat1b）、磷脂转运（stard7）和脂肪酸激活用于储存（acsbg2l/acsf3）的上调。蛋白质和氨基酸代谢类别中，FM组鱼上调与蛋白质折叠和细胞应激响应相关的转录本（hsp90ab1、pdia4、ero1b、tomm40）、氨基酸转运和维生素B6代谢（slc38a3b、plpbp）以及MAPK信号组分（map4k5）；FMF组鱼蛋白质合成和转运组分（eif2d、sec24c、metap2）及泛素特异性肽酶（usp5、usp31）表达增加。碳水化合物代谢类别中，FM组鱼上调xylb、pask、pmm1和agxt2；FMF组鱼上调糖酵解、糖异生和线粒体碳水化合物代谢相关基因（dlat、suclg1、pgam1b、pygmb、aldoa、gpi、slc35a3b、aco2、fh、ugp2b）。
**下丘脑功能类别**：FM组鱼摄食和摄食行为相关转录本（pmch2l、pmchl、pmch）强烈上调。激素调节基因呈现饲料依赖表达模式，FM处理中nr5a1和pparg上调；FMF组鱼nr3c1、grk3和camk2a上调，指向糖皮质激素信号激活和受体活性改变。FM组中营养感知和转运相关基因（itpr1、oxct1a、slc1a6、slc6a13、naa35）上调，另有aldh3a2b、slc6a9、slc7a11、mccc1及氨基酸转运基因slc7a14a和slc7a5上调。
**讨论部分总结**
性能比较需谨慎解释，鉴于试验持续时间短（40天）和初始鱼体较大（约1936 g），统计功效受桶水平重复（每处理3桶）和每桶生物学重复少（2尾）的限制。尽管如此，FM组鱼一致优于FMF组，终末体重和肥满度显著更高。虽然FCR、FE、SGR和FI无显著差异，但所有指标在FM处理中数值上更优，可能反映生物学意义。FCR差异（0.90 vs. 0.97）在商业生产规模下将转化为饲料成本和生物量产出的显著增加。FM组SGR（0.75%/天）与相似规格和温度条件下大西洋鲑的报道值一致，而FMF组较低的SGR（0.62%/天）表明饲料配方潜在的负面影响。摄食量分歧在第5天左右数值上显现，FM处理摄食量较高并持续整个实验期，表明大西洋鲑通过直接感官线索或摄食后反馈快速检测配方差异。尽管饲料设计为等能量，其他因素如微量营养素谱或适口性可能起作用。FI MBW在第19天后开始下降，即低于最适温度（18°C）开始后10天，与先前研究将长期暴露于高温（18°C–20°C）与摄食量降低相联系一致。
肝脏转录组分析表明FM和FMF饲料对肝脏脂质代谢有不同影响，脂肪酸生物合成（KEGG）在FMF处理中富集。尽管脂质水平相似，蛋白源差异（可能因氨基酸或微量营养素谱）可能驱动这些响应。FM组鱼富集的分子功能包括IP3门控钙通道活性、IP3结合和NAD+激酶活性，后者由dgkza、dgkz和cerkl上调支持。二酰甘油激酶占据钙信号和脂质第二信使周转的 junction，其富集与IP3相关术语一起表明钙依赖性脂质信号的协调激活而非孤立通路命中。与这一信号特征一致，FM组鱼上调脂质激活和膜重塑转录本（acsl3b、chpt1、dagla）以及醚脂合成和脂解相关基因（agps、abhd5）。FMF处理显示脂肪酸生物合成KEGG富集，由acsf3和acsbg2l驱动，同时fasn和dgat1b及脂质转运转录本rbp5和stard7上调，表明营养供应被重定向至脂质合成和储存而非体生长。脂肪酸和氨基酸代谢相互关联，鱼粉提供与脂质代谢相关的必需氨基酸，其用家禽副产物粉替代可能引入未表征的缺陷，导致FMF组鱼脂肪合成信号升高。总之，FM添加支持钙连接脂质信号和活跃重塑，而FM去除使肝脏转向从头脂肪合成和储存。
肝脏蛋白质和氨基酸代谢方面，FM组鱼PDI活性富集由pdia4和pdia3驱动，伴随hsp90ab1、ero1b和tomm40上调，跨越伴侣介导折叠、氧化蛋白折叠和线粒体蛋白输入，支持增强蛋白稳态能力的连贯解释。slc38a3b和plpbp表达升高与氨基酸转运和维生素B6代谢能力增加一致。MAPK组分map4k5和mapk15上调进一步暗示细胞应激调节。FMF处理显示蛋白质磷酸化和大分子修饰富集，由激酶信号和翻译后周转相关转录本驱动，指向调节信号和蛋白质周转升高而非特定代谢途径。FMF组鱼eif2d、sec24c和metap2上调，与蛋白质合成和细胞内转运相关，同时usp5和usp31上调与蛋白质降解相关，合成和降解转录本同时升高是蛋白质周转增加而非净蛋白质积累的特征。
肝脏碳水化合物和能量代谢方面，FM组鱼xylb、pmm1和pask上调提示替代糖代谢激活，agxt2表达增加将氨基酸分解代谢与碳水化合物代谢联系起来。FMF组鱼糖酵解和三羧酸（TCA）循环转录本（aldoa、gpi、pgam1b、pygmb、aco2、fh）驱动前体代谢物和能量生成富集，指向糖酵解通量和线粒体能量产生增加。钙离子跨膜转运蛋白活性和蛋白酪氨酸激酶活性富集进一步表明离子稳态和信号转导被优先考虑。这些术语共同表明鱼粉去除引发了对碳水化合物氧化的代偿性依赖以满足能量需求，抵消氨基酸可利用性或消化率的限制。
下丘脑转录组在處理间明显不同，FM组鱼显示神经内分泌和营养感知功能富集，FMF组鱼显示维持相关催化活性和离子结合功能富集。在解释下丘脑转录组信号前，需承认处理间摄食量差异也可能反映鱼粉的适口性和诱食特性，独立于中枢食欲调节机制。鱼粉含有游离氨基酸（ notably 牛磺酸和甘氨酸）、核苷酸和其他生物活性化合物，在硬骨鱼中是强效诱食剂。由于本研究未分析饲料水平游离氨基酸组成，无法直接区分下丘脑食欲调节响应和外周诱食剂驱动的摄食量差异。FM组鱼MCH活性富集由pmch、pmchl和pmch2l驱动，与饲料诱导的下丘脑基因表达差异一致，可能与能量平衡和稳态相关。MCH在硬骨鱼中的作用具有物种依赖性。在黄条鰤中，MCH表达随饲料和血清葡萄糖变化，pmch1和pmch2在鱼粉再投喂后上调，与本研究FM组鱼pmch/pmchl/pmch2l协调上调密切平行。cAMP磷酸二酯酶活性、PI3K通路组分和钙信号富集表明协调的细胞内信号，先前与虹鳟代谢调节和摄食行为相关。itpr1在钙、PI3K和IP3门控通道术语中反复出现，介导与鱼下丘脑脂肪酸感知相关的Ca2+流，其在多个富集术语中的重现表明它是该响应的枢纽转录本而非偶然命中。这一下丘脑脂肪酸感知特征与肝脏数据一致，FMF而非FM组鱼肝脏脂质生物合成转录本上调，表明FM处理中膳食脂质可利用性充足。传统调节摄食量的神经肽（如NPY、CART）未显示差异表达，可能被采样前禁食方法掩盖。
营养感知和能量稳态方面，FM组鱼缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路富集由oxct1a、aldh3a2b、mccc1和aox5驱动，跨越酮体利用、醛脱氢和支链氨基酸分解代谢。亮氨酸感知系统在鱼下丘脑中已确立，支链氨基酸分解代谢有助于摄食和能量稳态调节。这与奇努克鲑相反，后者等效通路富集主要在饲料效率较低鱼的外周组织中观察到，表明大西洋鲑下丘脑本身在膳食支链氨基酸供应高时参与支链氨基酸感知。FM组鱼进一步上调的转录本集中于营养感知及其下游整合，包括lrrn1、abcc1、trpm7、nr5a1、slc6a13、pde4b、map3k5、pparg和oxct1a。sirtuins已成为鱼下丘脑能量感知和食欲的调节因子，这些NAD+依赖性脱乙酰酶作为代谢开关将营养可利用性与摄食相关基因的转录控制联系起来。在大鼠中，sirt1通过sirt1/FoxO1通路抑制POMC神经元活性促进摄食量，并且是MCH诱导食欲刺激所必需的。FM组鱼sirt1与pmch、pmchl和pmch2l一起上调，与大西洋鲑中类似的关联一致，尽管仍有待直接检验。
FMF组鱼下丘脑显示更广泛功能类别富集，包括作用于蛋白质的催化活性和转移酶活性，由广泛的激酶和修饰因子组以及跨越氨基酸、脂质和碳水化合物处理的代谢转移酶驱动。这些基因集的组成以信号和翻译后修饰为主，而非神经肽或生长相关转录本，支持解释为细胞维持而非活跃可塑性或生长。金属离子和阳离子结合富集由离子处理和应激响应相关转录本驱动，表明离子稳态和应激适应优先，这些功能对维持大西洋鲑在受限营养条件下的神经性能至关重要。Nr3c1编码糖皮质激素受体，特别相关：它将代谢应激信号整合到能量稳态中，并与虹鳟摄食行为和欧洲海鲈热应激响应相关。camk2a、grm8和sox5在FMF组鱼中上调，提示突触和谷氨酸能信号调节。总之，与肝脏结果一起，这些发现为未来大西洋鲑鱼粉替代研究鉴定了候选生物标志物面板。下丘脑pmch、pmchl和pmch2l提供膳食鱼粉添加的协调、高幅度和方向一致的读数，sirt1和itpr1作为机制相关的营养感知状态次要标志物。肝脏中脂肪合成转录本（fasn、acsf3、acsbg2l）与脂质重塑转录本（acsl3b、abhd5）之间的对比提供了膳食脂质和蛋白质供应被导向储存还是周转的方向性指标，而nr3c1和hsp90ab1可作为并发热或营养应激负荷的标志物。通过qPCR在独立试验、饲料添加梯度和热方案中验证该面板将确定这些转录本是否可作为饲料配方和选择育种项目的实用指标。
**结论翻译**
在模拟塔斯马尼亚夏季条件（18°C）下，用家禽粉完全替代鱼粉显著降低了大西洋鲑的终末体重和肥满度，摄食量、饲料效率和特定生长率虽一致偏低但未达统计学显著。鉴于试验持续时间短和初始鱼体较大，这些性能差异为指示性而非确定性，转录组响应提供了更清晰的信号。鱼粉添加与肝脏脂质重塑和蛋白稳态能力一致的转录模式相关，同时下丘脑MCH和营养感知通路富集。鱼粉去除则倾向于肝脏从头脂肪合成和糖酵解，下丘脑谱偏向维持和应激相关转录本，即从底物周转向生物合成和稳态维持的转变，这与其他硬骨鱼摄食蛋白替代饲料后的响应一致。所得候选转录本面板值得在未来试验中作为膳食鱼粉状态的指标进行评估。解释仍受限于缺乏qPCR验证和膳食诱食剂定量，后者妨碍了将摄食差异单独归因于中枢食欲调节。
