肝移植前人供体肝脏细胞衰老的转录组学表征：DBD与DCD供体类型驱动差异化的衰老相关转录特征

《Aging Cell》：Transcriptomic Characterization of Cellular Senescence in Human Donor Livers Before Transplantation

　　

随着供体人群老龄化，器官获取与保存过程中的缺血和炎症损伤可能与影响移植物生物学的衰老相关程序相关。尽管供体类型特异的损伤模式已被认知，但其在驱动细胞衰老及下游炎症反应中的作用仍不清楚。研究人员对脑死亡后捐献（DBD，donation after brain death）和循环死亡后捐献（DCD，donation after circulatory death）供体获取的人体肝脏组织进行smart-3SEQ批量RNA测序（bulk RNA-sequencing）。研究采用SenMayo基因panel（senescence gene panel，衰老基因panel）和肝脏特异的衰老相关分泌表型（SASP，senescence-associated secretory phenotype）panel评估衰老相关转录特征，并通过免疫组织化学（IHC，immunohistochemistry）评估p16和p21蛋白表达，在外部队列的NanoString转录组数据中验证研究结果。研究共纳入66个肝脏（24个DBD和42个DCD）。1548个差异表达基因（differentially expressed genes）区分DBD和DCD移植物。功能富集分析显示不同的生物学程序：DBD移植物富集代谢通路、上皮增殖及血管生成调控；DCD移植物显示免疫激活、趋化因子信号及损伤相关通路富集。衰老相关分析重现了这一分离。免疫组织化学显示高危DCD肝脏中p16阳性核比例高于DBD肝脏（p = 0.038），而p21无显著差异（p = 0.687）。然而，瓦片水平（tile-level）分析显示DCD中p16与p21阳性核比例均显著更高（p < 0.001）。外部队列分析证实供体类型在全部可用转录本及衰老相关基因panel中的分离。供体类型反映人供体肝脏中不同的转录状态，衰老相关特征与供体类型特异的损伤反应重叠。损伤诱导的衰老相关信号可能影响移植物功能及受体（病理）生理，使其成为肝移植中有前景的可调控衰老细胞清除（senolytic）或衰老表型调节（senomorphic）靶点。

肝移植是终末期肝病患者的金标准治疗手段，但其应用长期受限于供体器官短缺，持续推高等待名单死亡率。为应对这一困境，循环死亡后捐献（DCD）移植物与脑死亡后捐献（DBD）器官被越来越多地共同使用。供体类型从根本上决定了移植物在移植前所经历的应激类型：DBD的特征是脑死亡后的全身炎症与血流动力学不稳定；DCD移植物则额外暴露于生命支持撤除与冷原位灌注之间的热缺血期，该阶段是缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury）的主要驱动因素，与原发性无功能及移植后胆管病（post-transplant cholangiopathy）等并发症密切相关。这些供体类型特异的缺血与炎症应激可能诱导细胞损伤反应，其中一条可能改变的通路是细胞衰老（cellular senescence），即由缺血-再灌注相关应激、线粒体功能障碍及活性氧介导的炎症信号诱导的稳定细胞周期阻滞与应激反应状态，并进一步表现为衰老相关分泌表型（SASP），其分泌的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶可破坏组织稳态并导致组织与免疫功能障碍。然而，供体类型特异的缺血与炎症损伤在多大程度上反映于移植前肝脏的生物状态仍属未知。基于此，研究人员提出假设：DBD与DCD移植物具有特异的衰老相关与炎症转录特征，并对静态冷保存（SCS，static cold storage）后的人体供体肝组织开展转录组分析，以明确供体特异损伤是否转化为移植前特异的全球及SASP相关转录特征。该研究的开展对于理解移植物生物学、优化供体评估以及探索潜在的干预靶点具有重要意义。

研究人员依托荷兰区域多器官获取团队的TransplantLines队列研究（University Medical Center Groningen），纳入2019年5月至2022年7月获取的66个人供体肝脏（24个DBD、42个DCD），肝组织活检在静态冷保存后于我方中心backtable准备时采集。主要关键技术方法包括：采用Smart-3SEQ协议完成批量RNA测序（bulk RNA-sequencing）；以DESeq2进行中位数比值法归一化与差异表达分析；利用主成分分析（PCA，principal component analysis）与置换多变量方差分析（PERMANOVA，permutational multivariate analysis of variance）开展无监督分析；通过基因本体论（GO，Gene Ontology）富集分析解析功能通路；采用SenMayo基因panel（125个基因）及基于既往文献构建的51个肝脏特异性SASP相关基因panel评估衰老相关转录特征；借助QuPath软件对p16与p21免疫组织化学切片进行定量；并在独立队列的NanoString nCounter靶向转录组数据（18个DCD和29个DBD移植物）中完成外部验证。

3.1 研究队列。研究共纳入66个人供体肝脏（24个DBD、42个DCD）。DCD组供体中位年龄为67岁，高于DBD组的55岁（p = 0.001）；DCD组功能性供体热缺血时间中位数为29分钟；DCD组供体风险指数（DRI，donor risk index）中位数为2.8，显著高于DBD组的1.8（p < 0.001）；两组静态冷缺血时间无显著差异（p = 0.121）。

3.2 全球转录组分析显示供体类型特异的转录特征。基于全转录组的无监督层次聚类显示DBD与DCD肝脏清晰分离（PERMANOVA: p = 0.001），PERMANOVA显示供体类型是全局转录变异的主要决定因素并解释最大比例的方差；年龄虽与全局转录变异相关，但性别、体重指数（BMI，body mass index）、冷缺血时间及肝切除时间等其他临床变量无显著关联。差异表达分析鉴定出1548个显著差异表达基因（p < 0.05且|log₂FC| > 1）。DBD肝脏高表达即刻早期及反应相关基因（AREG、FOSB），DCD肝脏高表达损伤与应激相关基因（FSCN1、AKR1B10）。功能富集显示DBD富集上皮增殖、缺氧与氧化应激反应、血管生成调控及葡萄糖代谢通路，DCD富集免疫细胞黏附与迁移、体液免疫反应及MHC Ⅱ类蛋白复合物组装通路。

3.3 衰老相关转录特征因供体类型而异。将分析限定于SenMayo基因panel（125个基因）时，PCA仍显示供体类型分离（PERMANOVA: p = 0.001），其中24个显著差异表达基因驱动该分离。DBD富集AREG、SERPINE1，DCD富集CXCL12及趋化因子相关或内皮/基质相关基因（ESM1、CCL24、CCL8、CXCL10、SERPINE2）。按表达差异幅度排序呈双向分布，DBD中IGFBP1、SERPINE1、AREG、ANGPTL4、CCL2、IGFBP6表达较高，DCD中CXCL12、CXCL10、CCL24、KITLG、ESM1、SERPINE2表达较高。通路富集方面，DBD相关信号富集体液免疫反应与单核细胞迁移，DCD相关信号在趋化因子信号与MAPK级联正调控上相对更强，趋化作用、上皮增殖、单核细胞增殖及血管生成正调控为共有富集。基于51个肝脏特异性SASP相关基因的panel显示可比分离（PC1: 24%，PC2: 16%，PERMANOVA: p = 0.001），DCD在上皮细胞增殖与MAPK信号调控上富集更强，DBD在单核细胞增殖上富集更强。

3.4 DCD肝脏显示衰老相关应激标志物p16和p21的免疫组化表达增加。随机亚组分析中，p16检测纳入9个DBD与11个DCD肝脏，p21纳入8个DBD与13个DCD肝脏。全感兴趣区（ROI，region of interest）水平，高危DCD肝脏p16阳性核比例显著高于DBD（p = 0.038），p21无显著差异（p = 0.687）；将ROI细分为方形瓦片（tile）后，tile水平显示DCD中p16与p21阳性核比例均显著更高（p < 0.001）。RNA水平上，CDKN2A（p16^INK4a/p19^ARF）在DCD中呈更高趋势（p = 0.229），而CDKN1A（p21^CIP1）在DBD中显著上调（p < 0.001）。

3.5 外部队列分析显示跨全部可用转录本及衰老相关转录本的供体类型分离。外部NanoString数据集含711个转录本，覆盖SenMayo的57个基因与肝脏特异性SASP panel的15个基因。基于全部转录本的PCA显示供体类型清晰分离（PERMANOVA: p = 0.001）；限定SenMayo基因集（PC1: 33%，PERMANOVA: p = 0.003）及肝脏特异性SASP panel（PC1: 43%，PERMANOVA: p = 0.002）时分离同样存在。差异表达分析鉴定出11个显著差异表达基因，多数在DBD中更高（FOS、EGR1、THBS1、DUSP6、CDKN1A、IL1R1、CXCR4、CCL2、IL8），TNFSF14在DCD中更高；CDKN1A（p21^CIP1）在DBD中显著更高（p < 0.001），与内部队列结果一致。

讨论部分指出，供体类型是移植前供体肝脏转录组谱的主要关联因素，较年龄、性别、BMI等供体特征及缺血时间等保存相关特征解释更多转录变异；尽管DCD供体更老且年龄贡献于转录变异，但在校正年龄后供体类型仍是最强贡献者，提示供体类型特异的损伤模式主要塑造了所观察到的差异。功能通路差异在机制上反映不同的损伤机制：DBD中脑死亡诱导全身炎症与血流动力学紊乱，DCD中移植物生物学由循环停止后的热缺血与缺氧塑造。限定于SASP相关基因集时同样观察到供体类型分离，且仅有限数量的差异表达基因即可驱动该分离（SenMayo的125个基因中仅24个），表明供体类型特异的损伤诱导了协调的衰老相关转录程序，而非广泛、均匀的转录改变。SASP成分可通过旁分泌与全身传播影响邻近及远处细胞，肝细胞衰老可诱导多器官功能障碍，衰老细胞亦可在受体内经SASP因子传播，老年供体器官移植入年轻受体会伴随移植物生存不良；但衰老的生物影响高度依赖时机与组织背景，快速诱导的衰老对组织修复至关重要，而低温机械氧合等可减轻缺血-再灌注损伤的干预提示调节氧化应激与衰老动态可能使衰老表现为修复反应或慢性功能障碍的驱动因素。细胞衰老日益被视为治疗靶点，senolytics（选择性清除衰老细胞）与senomorphics（不清除衰老细胞而减弱SASP及相关损伤通路）均为潜在策略，实验模型已证实清除或遗传靶向衰老细胞可恢复再生能力并改善移植物结局，离体机械灌注为在移植前直接向移植物递送此类疗法提供了平台。关于p16与p21评估遵循当前衰老多层评估建议，但转录组与蛋白水平的不一致可能源于：批量RNA测序对全样本取平均、无法解析衰老相关特征的细胞来源，免疫组化则提供空间信息；p21蛋白可经转录后机制及既有CDKN1A（p21^CIP1）转录本翻译在损伤组织中快速积累而不伴mRNA丰度增加；CDKN2A（p16^INK4a/p19^ARF）反映包括炎症与免疫细胞在内的多个细胞群，未必与p16蛋白直接对应。空间区室化方面，p16与p21核阳性主要定位于门管及门管周区域，与移植后胆管病的潜在关联值得关注，因胆管细胞中DNA损伤反应与SASP相关信号可能通过损伤胆管上皮再生能力而促进胆道损伤。研究局限性在于批量RNA测序与p16/p21免疫组化均不能单独确定衰老细胞，结果应解读为供体类型特异的衰老相关转录与蛋白改变而非衰老细胞负荷的直接定量；DCD供体更老构成潜在残余混杂；SenMayo等基因集捕获的转录通路与炎症信号及组织损伤重叠，衰老相关信号可能部分反映与细胞衰老交叉但非特异的应激反应；未来需借助单细胞RNA测序、空间转录组学、多重免疫染色及细胞类型特异性SASP检测明确贡献细胞群。研究结论为：供体类型反映人供体肝脏中不同的转录状态，衰老相关特征反映供体类型特异的损伤；超越其作为移植物质量标志物的潜在角色，损伤诱导的衰老相关信号可能影响移植物功能及受体（病理）生理，从而定位肝移植中有前景的可调控senolytic或senomorphic靶点。