ONC201通过非CLPP依赖途径差异性调控HPV阳性宫颈癌细胞的自噬反应

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：ONC201 (Dordaviprone/TIC10) Variably Modulates Autophagy Response in HPV-Positive Cervical Cancer Cell Lines in a CLPP-Independent Manner

ONC201（Dordaviprone/TIC10）是imipridone家族的首创成员，近期获得FDA快速通道批准用于复发性弥漫性中线胶质瘤。其在实体瘤和血液系统恶性肿瘤中显示出治疗前景和良好的安全性。研究人员近期报道了ONC201在宫颈癌细胞系中的体外疗效，尽管其对各细胞系靶点即酪蛋白裂解蛋白酶（CLPP）、TRAIL和DR5的效应存在差异。在本研究中，研究人员发现ONC201处理导致截然不同的表型结果，即HeLa细胞中显著的凋亡与SiHa细胞中的自噬。研究人员进一步证明，在两种细胞系中抑制自噬后出现相反的结果，即ONC201对SiHa细胞的凋亡诱导潜能增强，而HeLa细胞的凋亡反应受到抑制。使用siRNA的敲低研究表明，ONC201在HeLa细胞中对自噬的调控独立于其已知靶点CLPP，而CLPP被广泛报道在细胞保护性自噬中发挥作用。这是关于ONC201调控癌细胞自噬通路能力的首次报道。

研究背景方面，自噬在肿瘤发生发展中具有双重作用，既可抑制肿瘤生长亦可促进癌变。目前已报道四种主要自噬类型：细胞保护性、细胞毒性、细胞静止性和非保护性自噬。自噬与化疗及靶向治疗耐药密切相关，而凋亡（I型细胞死亡）与自噬（II型细胞死亡）之间存在复杂的交叉对话，共同决定细胞命运。ONC201作为imipridone家族首创分子，是线粒体蛋白酶CLPP的正向变构调节剂和多巴胺受体DRD2的拮抗剂，主要通过激活整合应激反应（ISR）和下调Akt/ERK信号通路发挥作用。宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，晚期治疗选择有限，亟需新型治疗策略。研究人员此前报道ONC201以TRAIL依赖和非依赖方式在HPV阳性宫颈癌细胞系中诱导ISR和细胞死亡，本研究进一步揭示ONC201对HPV16+（SiHa）和HPV18+（HeLa）宫颈癌细胞系自噬的差异性调控作用。

研究人员开展的研究及结论：本研究表明ONC201在宫颈癌细胞系中差异性调控自噬标志物LC3-II，在SiHa细胞中诱导自噬而在HeLa细胞中抑制自噬。氯喹预处理使SiHa细胞对低浓度ONC201敏感化并增强凋亡，而在HeLa细胞中ONC201的凋亡诱导阈值从10 μM升高至100 μM。siRNA敲低实验表明ONC201对HeLa细胞自噬的调控独立于CLPP。生物信息学分析显示CLPP高表达与宫颈癌患者生存改善正相关。该研究首次报道了ONC201调控癌细胞自噬通路的能力，提示抑制自噬可能作为克服治疗耐药的联合策略。

关键技术方法方面，研究人员采用MTT法检测细胞毒性并计算IC₅₀，克隆形成实验评估长期增殖能力，Western blot分析LC3-I/II、p62、cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白表达，免疫荧光检测LC3-II斑点，流式细胞术结合自噬报告探针和Annexin-V/PI双染分析自噬和凋亡，MitoTracker Green FM结合共聚焦显微镜观察线粒体形态，siRNA瞬转敲低CLPP结合qRT-PCR和Western blot验证敲低效率，以及UALCAN门户的in silico生存分析。细胞系SiHa（ATCC HTB-35）和HeLa（ATCC CCL-2）均购自ATCC。

研究结果方面，3.1 ONC201调控宫颈癌细胞的自噬：通过LC3-II免疫荧光和流式细胞术自噬报告探针检测，证实在SiHa细胞中ONC201处理显著增加自噬囊泡和红色荧光强度，诱导自噬。3.2 抑制自噬增强ONC201对SiHa而非HeLa的细胞毒性：氯喹预处理后，SiHa细胞增殖受到显著抑制，而HeLa无此趋势。3.3 氯喹增强ONC201对SiHa克隆形成能力的抑制而非HeLa：SiHa中氯喹预处理使ONC201在3 μM和5 μM即完全抑制集落形成；HeLa中ONC201单药即可消除集落，但氯喹预处理后集落重新出现。3.4 抑制自噬放大SiHa中ONC201诱导的死亡但削弱HeLa中的死亡：Annexin-V/PI检测显示氯喹预处理后SiHa细胞死亡显著增加，而HeLa细胞死亡显著减少。3.5 蛋白表达分析证实ONC201处理增加自噬及氯喹预处理的SiHa细胞中凋亡增加：SiHa中LC3-II升高、p62降低；HeLa中LC3-II/LC3-I比值降低。ONC201单药在HeLa 10 μM和30 μM即上调cleaved PARP和cleaved caspase-3，氯喹预处理后需100 μM才显著增加凋亡标志物；SiHa中氯喹预处理增强cleaved PARP水平，但两种条件下均未检测到cleaved caspase-3。3.6 ONC201诱导线粒体功能障碍：MitoTracker Green FM显示HeLa细胞在30 μM和100 μM ONC201处理下线粒体显著肿胀，SiHa细胞30 μM处理导致线粒体分裂而100 μM导致细胞器肿胀。3.7 ONC201对HeLa自噬的调控独立于CLPP：CLPP siRNA敲低效率达80%-90%，敲低未逆转ONC201对LC3-II的下调；CLPP敲低降低了ONC201对HeLa的细胞毒性（MTT法），但未显著改变ONC201处理后的克隆形成能力。营养饥饿条件下，ONC201无法诱导HeLa凋亡（无cleaved PARP）但仍诱导ISR（ATF4升高）。In silico分析显示CLPP高表达与宫颈癌患者生存改善正相关（n=74 vs n=217）。

讨论部分总结：研究人员讨论指出，Beclin-1在SiHa中对ONC201响应上调，支持ONC201诱导SiHa自噬的假设。氯喹预处理使SiHa对10 μM ONC201敏感化（cleaved PARP增加），而HeLa凋亡阈值从10 μM升至100 μM，提示自噬在SiHa中保护细胞免受ONC201诱导的凋亡，而在HeLa中发挥细胞毒性作用。ONC201可能通过抑制Akt/ERK/mTOR通路、DRD2信号、ISR-ATF4通路及Bcl-xL非经典功能等多途径调控自噬。HPV16和HPV18可能决定SiHa和HeLa对ONC201的不同细胞响应。MitoTracker Green荧光强度增加可能反映线粒体内错误折叠蛋白池增加。CLPP敲低降低ONC201对HeLa的短期细胞毒性但不影响长期克隆形成能力，表明ONC201的长期效力可能独立于CLPP。研究局限性在于仅基于CLPP敲低得出结论，Akt/ERK或DRD2等其他信号通路也可能介导该效应。

研究结论翻译：总之，本研究表明尽管ONC201在两种宫颈癌细胞系中均诱导ISR，但在宫颈癌细胞中导致不同的主要表型结果，即HeLa中凋亡和SiHa中自噬。抑制自噬促进SiHa而非HeLa中的凋亡。ONC201似乎推动HeLa细胞从天然细胞保护性自噬状态向凋亡转变。然而，ONC201对HeLa细胞自噬的调控可能独立于CLPP。未来研究有必要探讨ONC201诱导ISR下游的不同表型结果（凋亡和/或自噬）是否可归因于SiHa和HeLa中不同HPV亚型（16 vs 18）的存在。研究ONC201的自噬调控是否在其他类型癌症中观察到也值得关注。ONC201对自噬的抑制作用表明其有潜力纳入联合方案以克服治疗耐药。