多组学解析TM4SF4+上皮细胞亚群与MMP14相关信号程序在肺腺癌发病机制及微环境重塑中的作用

《Journal of Cell Communication and Signaling》：Multi-omics analysis highlights TM4SF4+ epithelial cells and the MMP14-associated signaling program in lung adenocarcinoma pathogenesis and microenvironment remodeling

肺腺癌（LUAD）的进展受异质性肿瘤微环境（TME）内异常的细胞–细胞及细胞–基质通讯所塑造。本研究整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、全基因组关联研究（GWAS）及空间转录组学，以鉴定与该交互通讯相关的上皮亚群。通过分析GSE196303 scRNA-seq数据，研究人员解析出15个上皮亚群。利用scPagwas分析，TM4SF4⁺亚群对LUAD遗传易感性显示出最高的性状相关性评分（校正p < 0.05）。对TCGA-LUAD数据进行BayesPrism去卷积分析，揭示TM4SF4⁺细胞在肿瘤中富集；在中位截断分析中，高丰度与较差的总生存期相关（风险比 = 1.43，95%置信区间 = 1.07–1.92，p = 0.016），并与TME重塑特征相关（免疫/基质评分降低及肿瘤纯度升高）。加权基因共表达网络分析（WGCNA）和多证据交集确定MMP14为候选枢纽基因。空间转录组学支持MMP14的异质性分布，功能富集将MMP14相关转录程序与细胞外基质（ECM）重塑、迁移及Hedgehog/Notch通路联系起来。表达验证证实MMP14在LUAD细胞和组织中上调。总之，TM4SF4⁺上皮细胞和MMP14相关程序可能促进LUAD进展和TME重塑，支持它们作为候选生物标志物和潜在治疗靶点以供进一步验证。

**研究背景与问题**

肺癌仍是全球致死率最高的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌（NSCLC）占其中大多数病例，而肺腺癌（LUAD）是NSCLC中最常见的亚型。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICIs）改善了部分患者的预后，但疗效的显著变异性、频繁复发和耐药性持续存在。LUAD显著的瘤内异质性是治疗不确定性的主要来源之一，这种异质性不仅源于肿瘤细胞的基因组演化和表型可塑性，还源于肿瘤微环境（TME）的动态重塑。TME中的免疫细胞、基质细胞和细胞外基质（ECM）共同影响免疫逃逸、侵袭转移和治疗反应。为在机制与临床应用之间建立可解释的桥梁，鉴定反映疾病过程的“细胞状态”和驱动网络至关重要。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已揭示LUAD中肿瘤细胞和TME的广泛异质性，空间转录组学进一步证明肿瘤进展中的细胞可塑性和微环境重塑呈现空间区室化和梯度特征。GWAS已鉴定多个与肺癌/LUAD相关的风险位点，但这些发现的功能解释常需映射回特定细胞类型和状态。在此背景下，肿瘤上皮细胞亚群直接体现增殖、侵袭和转移等核心恶性表型，已成为研究焦点。Transmembrane 4 superfamily member 4（TM4SF4）与黏附和信号整合有关，可能影响免疫逃逸；Matrix metalloproteinase 14（MMP14，又称MT1-MMP）被认为是ECM降解和肿瘤侵袭的关键因子，并介导细胞间及细胞–基质信号传导。本研究旨在通过检视肿瘤异质性和细胞生态系统，系统研究LUAD中关键上皮细胞亚群的生物学意义和潜在临床价值，阐明上皮细胞异质性在肿瘤发生和进展中的机制作用，并探索其与遗传背景、微环境调控和疾病进展的内在联系。

**主要技术方法**

研究人员采用“单细胞分析—遗传关联—队列验证—机制探索—实验验证”的整合策略。主要关键技术方法包括：基于GSE196303 scRNA-seq数据集（3例LUAD肿瘤样本及3例配对的癌旁非肿瘤样本）进行单细胞转录组分析；利用IEU OpenGWAS数据库的LUAD GWAS汇总统计数据（1002例病例和462,008例对照）进行scPagwas遗传关联分析；使用BayesPrism对TCGA-LUAD队列（541例LUAD肿瘤组织和59例正常肺组织）进行去卷积分析；采用WGCNA和多证据交集筛选枢纽基因；利用GSEA进行功能富集分析；使用公共空间转录组数据集GSM5702474（LUAD）和GSM5388415（正常远端肺）进行空间验证；通过RT-qPCR和免疫组化（IHC）在A549细胞系、BEAS-2B细胞系及哈尔滨医科大学附属第一医院6对配对LUAD临床样本中进行表达验证。

**研究结果**

**3.1 利用scRNA-seq和scPagwas分析鉴定LUAD核心上皮细胞亚群**

通过对GSE196303数据集进行质量控制和下游分析，共鉴定出22个细胞簇，基于经典标记基因注释为7种主要细胞类型：T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。进一步分离上皮细胞进行二次聚类，鉴定出15个上皮细胞亚群，热图显示上皮细胞存在显著转录异质性。整合LUAD GWAS汇总统计数据，利用scPagwas计算各上皮细胞亚群的性状相关性评分（TRS），结果显示TM4SF4⁺上皮细胞亚群具有最高的TRS，TRS信号呈集中空间分布，表明该亚群与LUAD遗传风险关联最强。Bootstrap重采样和效应量估计进一步支持该结果。

**3.2 TM4SF4⁺上皮细胞在TCGA-LUAD中显著富集并预测不良预后**

在TCGA-LUAD队列中进行肿瘤与正常肺组织差异表达分析，共鉴定出14,637个差异表达基因（DEGs），包括11,552个上调和3,085个下调基因。以scRNA-seq定义的15个上皮细胞亚群为参考，应用BayesPrism对TCGA批量RNA-seq样本进行去卷积，获得每个样本的上皮亚群相对丰度谱（theta）。肿瘤与正常组织比较显示多个上皮亚群丰度发生显著变化，TM4SF4⁺上皮细胞在肿瘤组织中显著富集。以中位丰度为截断值将患者分为高、低丰度组，中位截断Cox分析显示高TM4SF4⁺丰度与显著缩短的总生存期（OS）相关（HR = 1.43，95% CI = 1.07–1.92，p = 0.016）。IGHG3⁺上皮细胞高丰度同样与较差OS相关。采用中位分割、三分位比较和最优截断点多策略敏感性分析，TM4SF4⁺和IGHG3⁺上皮细胞与不良预后的关联在不同方法下保持一致且显著。在多变量Cox模型中调整年龄、性别和病理分期后，TM4SF4⁺和IGHG3⁺上皮细胞高丰度仍与OS独立相关。

**3.3 TM4SF4⁺上皮细胞丰度与LUAD免疫微环境的关联**

以中位截断值（theta = 0.00612）将患者分为高、低丰度组（n = 258 vs. 258）。上皮微环境分析显示，TM4SF4⁺高丰度肿瘤中上皮亚群组成显著重塑：CXCL14⁺和LAMP3⁺上皮细胞相对丰度增加，而SPP1⁺、FN1⁺、CCL5⁺、WSB1⁺和CST6⁺上皮细胞相对丰度降低。利用ESTIMATE算法计算基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分并推断肿瘤纯度，结果显示与低丰度组相比，高丰度组基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分显著降低，而肿瘤纯度显著升高，共同表征“低免疫/基质评分—高肿瘤纯度”的微环境特征。调整病理分期后，与基质、免疫和ESTIMATE评分的关联仍显著。将TM4SF4⁺丰度作为连续变量分析，发现其与基质、免疫和ESTIMATE评分显著负相关，与肿瘤纯度正相关。进一步调整肿瘤纯度后，TM4SF4⁺丰度与基质评分保持稳健的独立负相关，但与免疫评分的残余关联方向发生改变，提示“免疫评分降低”在统计学上更大程度由肿瘤纯度驱动，而与基质成分减少的关联更为稳定。

**3.4 TM4SF4⁺上皮细胞丰度与LUAD体细胞突变及药物敏感性的相关性**

突变谱概览显示TP53突变频率最高，其次为TTN和MUC16。比较高、低丰度组，TP53和KRAS在两组中均为最常突变基因，但突变组成存在差异：TP53突变在低丰度组更常见，KRAS突变在高丰度组更常见，但均未达到BH校正FDR阈值。更重要的是，高丰度组显示KEAP1和STK11等关键驱动基因突变富集，提示与代谢应激、氧化还原稳态和肿瘤抑制通路失活相关的共突变景观。利用oncoPredict推断两组患者的药物反应谱，与低丰度组相比，TM4SF4⁺高丰度组对Doramapimod、Obatoclax Mesylate、Tozasertib、Bortezomib和Entospletinib等多种药物显示更高的预测反应值，提示潜在治疗敏感性；反之，高丰度组对Dihydrorotenone、Sapitinib、Ulixertinib、Acetalax和Lapatinib等药物显示较低的预测反应值，提示相对耐药。

**3.5 通过WGCNA和多证据交集鉴定TM4SF4⁺上皮相关枢纽基因，突出MMP14为候选靶点**

基于TCGA-LUAD表达数据构建WGCNA，共鉴定出17个共表达模块，其中MEtan模块与TM4SF4⁺细胞评分呈显著正相关。将MEtan模块基因、TCGA肿瘤–正常DEGs和scRNA-seq鉴定的TM4SF4⁺上皮细胞标记基因进行交叉参照，多证据方法获得6个一致支持的候选枢纽基因：LOXL1、DCBLD2、MMP14、MXRA5、VCAN和PLAU。这6个基因在TCGA-LUAD肿瘤组织中较正常组织显著上调。KM分析显示MMP14高表达组OS较差。Cox比例风险模型进一步证实MMP14与不良预后的显著独立关联：单变量HR = 1.252（95% CI：1.102–1.423，p < 0.001），多变量调整HR = 1.378（95% CI：1.142–1.663，p < 0.001）。外部队列（KM-Plotter）验证显示一致趋势。临床病理层面，单变量逻辑回归显示高MMP14表达与进展期T分期、淋巴结阳性和更高总体病理分期正相关，与M分期、性别、年龄或吸烟史无显著关联。

**3.6 MMP14相关转录程序的功能富集分析揭示ECM重塑/迁移侵袭及免疫相关通路**

将样本分为MMP14高、低表达组进行单基因差异分析并生成排序基因列表，GSEA结果显示高MMP14表达组中多个肿瘤相关和免疫功能障碍相关KEGG通路显著正富集，包括膀胱癌、原发性免疫缺陷和NSCLC等代表性通路，Hedgehog信号通路和Notch信号通路也显示显著富集。Reactome通路分析中，高MMP14表达组显著富集于弹性纤维形成、非整合素膜ECM相互作用、Met促进细胞运动和胶原链三聚化等与ECM重塑、细胞–ECM相互作用和迁移活动相关的通路。低MMP14表达组则显著富集于转录和表观遗传调控相关生物过程。综合KEGG和Reactome富集结果，MMP14高表达相关程序呈现“ECM重塑—迁移侵袭—免疫通路改变”的一致功能方向性。

**3.7 空间转录组学验证MMP14在LUAD组织内呈结构化的空间异质性分布**

利用GSM5702474和GSM5388415空间转录组数据，MMP14在LUAD和正常远端肺组织中呈现明显的空间异质性。GSM5702474切片中MMP14信号形成局部高表达“热点”，呈近似椭圆形聚集模式，提示其表达可能与肿瘤核心或侵袭前沿等特定微环境生态位相关。正常远端肺切片GSM5388415则显示更为弥散的MMP14信号，呈细长空间分布。

**3.8 细胞和组织水平验证证实MMP14在LUAD中显著上调**

RT-qPCR显示LUAD细胞系A549中MMP14 mRNA表达显著高于正常支气管上皮细胞系BEAS-2B。配对临床样本的半定量IHC显示肿瘤组织中MMP14蛋白表达显著高于癌旁非肿瘤组织。代表性H&E和IHC切片进一步显示肿瘤区域更强的棕色显色染色，并可见信号富集的局灶区域。这些结果共同表明MMP14在LUAD中mRNA和蛋白水平一致上调。

**讨论与结论**

本研究整合scRNA-seq、GWAS和批量转录组数据，系统分析LUAD上皮异质性，首次基于遗传易感性鉴定TM4SF4⁺上皮细胞亚群为LUAD核心细胞状态。该亚群不仅在GWAS性状关联评分中排名最高，还与免疫抑制性TME、特定突变谱和不良预后显著相关。与仅依赖表达聚类鉴定亚群的传统方法相比，本研究建立了“遗传风险—细胞状态—临床结局”的整合框架，增强了关键亚群鉴定的因果可解释性和转化适用性。TM4SF4此前被报道与肝细胞癌和结直肠癌等上皮性肿瘤的迁移、侵袭和上皮–间质转化（EMT）相关，主要被视为“转移标志物”。本研究将TM4SF4鉴定为特定上皮细胞亚群的核心标志物，并揭示这些亚群在TME中的调控作用，标志着从“单一分子功能”到“细胞状态调控者”的概念转变。TM4SF4⁺细胞亚群表现出独特的转录特征，包括基质金属蛋白酶（如MMP14）的显著上调表达，提示其参与ECM重塑和侵袭进展。研究人员提出其不良预后效应可能通过两条主要途径介导：第一，将MMP14相关的ECM降解程序与侵袭和转移潜能联系起来；第二，营造免疫抑制性TME，从而促进免疫逃逸。高丰度TM4SF4⁺样本表现出IFNG信号降低、CD8⁺ T细胞浸润减少以及免疫和基质评分降低，该表型与已知的ICI耐药特征密切相似。突变景观层面，KRAS突变在高TM4SF4表达患者中显著富集，而TP53突变比例降低，提示该亚组可能代表特定分子亚型的独立演化路径。药物敏感性分析进一步表明该亚组可能对硼替佐米等蛋白酶体抑制剂更敏感，而对EGFR抑制剂显示耐药趋势。作为TM4SF4⁺亚群的核心效应分子，MMP14与恶性特征的关联已在多个层面得到验证。空间转录组学进一步揭示MMP14在LUAD和正常远端肺切片中的异质性空间分布。因此，TM4SF4/MMP14轴可能代表LUAD进展中的关键调控通路，为靶向治疗开发提供稳健立足点。本研究存在若干局限性：单细胞图谱来源于GSE196303（3例LUAD肿瘤样本和3例配对癌旁非肿瘤样本），仍需独立LUAD scRNA-seq队列确认TM4SF4⁺上皮簇的可重复性和标志物结构；未进行拷贝数变异或inferCNV分析；TM4SF4⁺上皮细胞的细胞起源和演化轨迹尚未解决；scPagwas分析使用的IEU OpenGWAS汇总统计存在病例–对照不平衡，结果应解释为优先级证据而非确定性因果证明；批量去卷积结果依赖算法假设；研究主要利用公共数据库回顾性数据，缺乏前瞻性队列验证；TM4SF4与MMP14的调控关系尚未通过基因编辑、敲低/过表达、类器官或体内模型进行机制验证；药物敏感性预测基于计算机模型，需进一步体外或患者来源异种移植模型验证；TME中其他细胞类型（如树突状细胞和髓源性抑制细胞）与TM4SF4⁺亚群的相互作用尚不清楚。

结论部分翻译：本研究整合scRNA-seq、scPagwas、TCGA去卷积和多组学验证，系统表征LUAD上皮细胞异质性并优先确定疾病相关上皮细胞状态。研究人员鉴定出15个上皮细胞亚群，其中TM4SF4⁺上皮细胞在scPagwas中显示最高TRS，并与LUAD遗传风险显著相关。在TCGA-LUAD中，该亚群在肿瘤组织中显著富集，高丰度稳定预测较差的OS并显示潜在独立预后价值。TM4SF4⁺高丰度肿瘤呈现“低免疫/基质评分—高肿瘤纯度”的微环境特征，伴随特定上皮生态位重塑和KRAS/KEAP1/STK11驱动突变富集，以及独特的药物敏感性预测谱。此外，WGCNA和汇聚多证据分析鉴定MMP14为与TM4SF4⁺细胞相关的候选枢纽基因。功能富集分析提示其参与ECM重塑和迁移/侵袭通路。空间转录组学揭示MMP14的结构化异质性分布，其mRNA和蛋白水平在细胞系和临床组织中均显著上调。总之，TM4SF4⁺上皮细胞及相关MMP14程序可能作为LUAD的分层标志物和候选治疗靶点，为未来风险评估和精准治疗研究提供基础。