空间转录组学揭示远端胆管癌神经周围侵袭中深度依赖的神经生长因子上调与M2样巨噬细胞富集

《The Journal of Pathology》：Spatial transcriptomics reveal depth-dependent nerve growth factor and M2-like macrophage enrichment in the perineural invasion of distal cholangiocarcinoma

神经周围侵袭（perineural invasion, PNI）是远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma）常见的病理特征，但与其相关的空间分子程序尚不清楚。研究人员旨在利用空间转录组学（spatial transcriptomics）及独立验证刻画与PNI相关的肿瘤–神经–免疫相互作用。研究采用GeoMx数字空间分析仪（GeoMx Digital Spatial Profiler）对6例手术切除的远端胆管癌（非PNI，n = 3；PNI，n = 3）进行空间转录组分析。感兴趣区（region of interest, ROI）包括非PNI肿瘤区、未接触神经的表面黏膜肿瘤区（PNI-surface）以及邻接S100阳性神经的肿瘤区（PNI-perineural）。肿瘤区室通过CK19（cytokeratin 19）分割富集。差异表达与通路分析分别采用iDEP/DESeq2及Reactome/京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析完成。蛋白水平验证在独立队列（非PNI，n = 22；PNI，n = 82）中通过免疫组织化学（immunohistochemistry）检测神经生长因子（nerve growth factor, NGF）、CD68及CD163。另外9例标本采用组织透明化（tissue clearing）技术评估三维神经结构。PNI相关区室与非PNI区域呈现截然不同的转录组特征。与非PNI相比，PNI-surface有109个差异表达基因（34个上调、75个下调），PNI-perineural有179个（64个上调、115个下调）。通路分析显示免疫相关、微环境相关及神经营养相关程序富集，其中包括NGF相关特征。PNI阳性肿瘤中肿瘤细胞NGF表达显著升高（中位H评分（H-score）：215对119，p < 0.0001），且在PNI病例中随侵袭深度加深而升高（p < 0.0001）。PNI阳性肿瘤的深部侵袭区CD68阳性巨噬细胞（中位313对210个/高倍视野（high-power field, HPF），p < 0.001）与CD163阳性巨噬细胞（中位64对40个/高倍视野，p < 0.001）均显著增加。CD163/CD68比值在深部区域高于浅表区域，且此变化特异出现于PNI阳性肿瘤（p < 0.0001）。PNI阳性远端胆管癌呈现空间特异的肿瘤程序及涉及NGF上调与M2样巨噬细胞（M2-like macrophage）富集的、深度依赖的微环境重塑，从而提示潜在治疗靶点。

远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma）是起源于肝外胆管的恶性肿瘤，预后不良，根治性切除后局部复发仍常见。神经周围侵袭（perineural invasion, PNI）为其最常见组织病理特征之一，与肿瘤广泛侵袭、早期复发及不良生存相关；PNI指肿瘤细胞沿、在或围绕神经鞘浸润扩散，机制有别于淋巴道或血管侵袭，但肿瘤细胞优先侵犯神经结构的机制未明。既往研究提示神经营养信号（以神经生长因子（nerve growth factor, NGF）为核心）与肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）参与PNI，但其深度依赖分子程序、神经营养因子的空间调控及与三维神经结构的关系仍不清楚，常规Bulk转录组亦会掩盖区室特异性程序。为此，研究人员整合空间转录组学、蛋白验证与组织透明化成像解析PNI空间生物学并寻找治疗靶点。研究对6例手术切除标本行空间转录组分析，界定非PNI区、PNI-surface区与PNI-perineural区，并在104例独立队列行免疫组化验证、9例标本行三维神经成像验证。结论为：PNI阳性远端胆管癌存在空间特异的肿瘤程序与深度依赖的微环境重塑（NGF上调、M2样巨噬细胞富集），为肿瘤–神经–免疫互作提供新框架，NGF与巨噬细胞极化是潜在治疗靶点。

关键方法上，研究人员采用GeoMx数字空间分析仪（GeoMx Digital Spatial Profiler）对福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）组织行全转录组空间分析，基于CK19（cytokeratin 19）分割富集肿瘤区室；差异表达分析采用iDEP.96流程与DESeq2（差异基因定义为校正p < 0.1且|log₂FC| > 1），通路富集采用Reactome与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）；蛋白验证在104例独立队列（Hirosaki大学医院2003–2016年切除标本）中对NGF、CD68、CD163行免疫组织化学并按侵袭深度分层定量；三维神经分析采用组织透明化、全标本免疫荧光、共聚焦成像及Imaris软件Filament Tracer模块神经纤维追踪。

研究结果：

患者队列与感兴趣区分类：空间转录组学纳入6例远端胆管癌（非PNI 3例、PNI阳性3例），PNI-surface与PNI-perineural区室取自同一病例同一组织切片，实现病例内空间比较，CK19分割保证肿瘤区室富集的转录组分析。

非PNI、PNI-surface与PNI-perineural区室的空间转录组差异：无监督聚类显示三区室转录组明显分离；PNI-surface有109个差异表达基因（34个上调、75个下调），PNI-perineural有179个（64个上调、115个下调）；两PNI区室直接比较无显著差异基因，基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）提示PNI-perineural相对富集组织重塑与肿瘤相关信号、PNI-surface相对富集免疫相关通路。

差异表达基因定量总结与功能注释：上调基因中19个为两比较共享、45个为PNI-perineural特有、15个为PNI-surface特有，下调基因中59个共享、56个及16个分别特有；PNI-surface上调基因富集于细胞外基质糖蛋白与中性粒细胞脱颗粒，下调基因关联WNT（wingless相关整合位点家族）信号依赖的TCF（T细胞因子）分化、胶质细胞及上皮细胞分化；PNI-perineural上调基因富集于白细胞活化调节、血管发育及NGF刺激转录，下调基因关联细胞因子信号、mTOR（雷帕霉素靶蛋白，mechanistic target of rapamycin）信号与代谢过程。

免疫组化验证队列中PNI频率、T分期关联与生存分析：PNI阳性率随T分期加深而升高（pT1为59.5%、pT2为88.9%、pT3与pT4均为100%），PNI阳性患者总生存显著更差（log-rank p < 0.001）。

NGF表达的免疫组化验证：PNI病例NGF H评分显著高于非PNI病例（p < 0.0001），浅表区（p < 0.05）与深部区（p < 0.001）均更高；仅PNI病例深部NGF显著高于浅表（p < 0.0001），证实深度依赖性增强。

巨噬细胞浸润与极化的免疫组化分析：PNI病例CD68阳性（泛巨噬细胞标志物）总数显著升高、深部区显著增加（中位313对210个/高倍视野，p < 0.001）；CD163阳性（M2样巨噬细胞标志物）总数无组间差异，但PNI病例深部区显著增加（中位64对40个/高倍视野，p < 0.01）；PNI病例深部CD163/CD68比值较浅表显著升高（p < 0.0001），提示深部侵袭区巨噬细胞积累伴相对M2样极化。

神经结构的三维分析：非PNI肿瘤神经稀疏简单，PNI阳性肿瘤S100阳性神经网络更复杂并穿插于CK19阳性肿瘤细胞巢之间；神经长度密度、分支密度与神经体积分数在PNI病例呈一致升高趋势但未达统计学显著。

讨论与结论：研究人员指出PNI阳性肿瘤存在空间结构化的肿瘤细胞状态，神经周围区室转录组重塑更广泛，向神经周围表型转变涉及多基因协调适应而非单一开关；NGF相关神经营养程序在神经周围区室富集并获蛋白验证，巨噬细胞积累与极化呈深度依赖，提示浅表活检可能低估深部PNI肿瘤的神经营养与免疫抑制潜能，三维神经指标的升高趋势为未来拓扑分析奠定基础。研究存在发现队列每组仅3例、单机构回顾性验证、巨噬细胞表型鉴定局限（仅CD68与CD163）、三维队列较小及观察性设计等局限，故空间转录组结果应视为探索性。研究结论为：PNI阳性远端胆管癌呈现空间特异的肿瘤程序及涉及NGF上调与M2样巨噬细胞富集的、深度依赖的微环境重塑，并据此识别潜在治疗靶点；结合互补空间平台发现，为PNI中肿瘤–免疫–神经相互作用提供研究框架；未来需采用更大队列与亚细胞分辨率平台实现连续距神经距离分析并关联早期复发表型。