多尺度侵袭相关增殖特征谱分析联合空间验证赋能肺腺癌非侵入性CT预后预测

《Neoplasia》：Multi-Scale Invasion-Associated Proliferative Profiling with Spatial Validation Enables Non-Invasive CT-Based Prognosis in Lung Adenocarcinoma

肺腺癌（LUAD）是最常见的非小细胞肺癌（NSCLC）亚型，具有显著的生物学异质性，导致总生存期（OS）结局差异显著。尽管肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期系统提供了总体预后框架，但其粒度不足以区分同一病理分期内的结局差异。目前，量化肿瘤内异质性及相关恶性表型的非侵入性工具仍然有限，制约了临床治疗决策。识别关键生物学程序并将其转化为临床适用的风险评估工具因此具有重要的临床意义。肿瘤干细胞特性表现为分化降低及获得干细胞样特性，与肿瘤进展、微环境改变及治疗耐药相关。现有的干细胞指数，包括mRNA干细胞指数（mRNAsi）和CytoTRACE2，已在多种癌症类型中证明了预后相关性，但其应用通常依赖肿瘤来源的转录组数据，限制了向常规非侵入性临床评估的直接转化。特别是，CytoTRACE2依赖单细胞转录组分析，而mRNAsi提供的是Bulk转录组来源的度量，可能受细胞异质性影响。尽管这些方法为干细胞相关生物学提供了有价值的见解，但整合增殖、代谢和免疫相关转录特征并在多个队列中表征其空间组织模式的分子特征仍有待建立。影像组学可从常规医学影像中非侵入性地提取高通量定量特征，但传统影像组学模型往往作为缺乏生物学可解释性的“黑箱”运行。生物学锚定的影像组学模型将特征选择与特定分子程序相关联，为将分子见解转化为潜在的影像生物标志物提供了一条途径。因此，本研究开发了一种IAPS锚定的影像组学框架，通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、多队列Bulk转录组学和空间转录组学构建了一个141基因的侵袭相关增殖特征（IAPS）。IAPS代表一种侵袭相关的增殖性转录程序，作为分子参考用于从常规CT影像中识别相关影像组学特征。这些特征随后被纳入深度生存网络（DeepHit）生存模型，用于LUAD的非侵入性预后预测，无需额外的侵入性组织分子分型。在独立验证中，DeepHit模型取得了0.793的一致性指数（C-index）。这种分子层面信息的影像组学框架提供了将多尺度转录组学洞察转化为临床适用预后生物标志物的潜在策略。

肺腺癌（LUAD，lung adenocarcinoma）是最常见的非小细胞肺癌（NSCLC，non-small cell lung cancer）亚型，具有显著的生物学异质性，导致总生存期（OS，overall survival）结局存在明显差异。尽管肿瘤-淋巴结-转移（TNM，tumor-node-metastasis）分期系统提供了总体预后框架，但其分辨粒度不足以区分同一病理分期内的不同结局。目前，能够量化肿瘤内异质性及相关恶性表型的非侵入性工具仍然有限，制约了临床治疗决策。因此，识别驱动恶性进展的关键生物学程序并将其转化为临床适用的风险评估工具具有重要的临床意义。现有的肿瘤干细胞指数如mRNA干细胞指数（mRNAsi，mRNA stemness index）和CytoTRACE2已在多种癌症类型中证明了预后相关性，但其应用通常依赖肿瘤来源的转录组数据，限制了向常规非侵入性临床评估的直接转化。同样，传统影像组学（Radiomics）模型往往作为缺乏生物学可解释性的“黑箱”运行，亟需建立生物学锚定的影像组学模型以连接分子层面发现与临床转化应用。

研究人员开展了整合单细胞RNA测序（scRNA-seq，single-cell RNA sequencing）、多队列Bulk转录组学及空间转录组学的研究，构建了一个141基因的侵袭相关增殖特征（IAPS，Invasive-Associated Proliferative Signature），并将其转化为基于常规CT影像的非侵入性预后预测工具。研究得出以下核心结论：IAPS在跨队列中表现出与不良生存结局的可重复关联，空间转录组学分析显示IAPS与糖酵解肿瘤区域相关联，基于IAPS筛选的影像组学特征所构建的DeepHit深度生存模型在独立验证集中取得了0.793的一致性指数（C-index，concordance index）。这项研究的重要意义在于建立了从多尺度转录组学洞察到临床适用预后标志物的转化路径，为肺腺癌的个体化围术期管理提供了潜在的非侵入性评估策略。

本研究整合四种数据模态：Bulk转录组学、单细胞转录组学、空间转录组学及影像组学。Bulk水平分析以TCGA-LUAD作为发现队列，并采用五个外部队列（GSE229705、GSE116959、GSE30219、GSE31210及GSE75037）进行验证。单细胞RNA测序数据（GSE189357）覆盖从原位腺癌（AIS，adenocarcinoma in situ）到浸润性腺癌（IAC，invasive adenocarcinoma）的进展轨迹。配对10x Visium空间转录组数据（GSE189487）包含六个组织切片，跨越AIS、微浸润性腺癌（MIA，minimally invasive adenocarcinoma）和IAC阶段。CT影像数据从五个癌症影像档案（TCIA，The Cancer Imaging Archive）数据集中获取，以组装影像组学训练集（n = 250）和影像-转录组配对队列（n = 182）。独立验证队列包含145例经组织学确诊的LUAD手术患者。关键分析技术包括：单细胞水平采用Seurat（v5.0.2）处理及CytoTRACE2评估细胞发育潜能；Bulk水平利用OCLR（one-class logistic regression）模型计算mRNAsi并进行差异表达及相关性筛选；通过过表征分析（ORA，over-representation analysis）精炼基因集构建IAPS；采用ESTIMATE算法及单样本基因集富集分析（ssGSEA，single-sample gene set enrichment analysis）评估肿瘤微环境（TME，tumor microenvironment）及免疫浸润；运用多模态交集分析进行空间细胞类型注释；影像组学采用PyRadiomics提取特征，经类内相关系数（ICC，intraclass correlation coefficient）筛选及ComBat协调后，利用最小绝对收缩和选择算子（LASSO，least absolute shrinkage and selection operator）Cox回归降维，最终构建DeepHit深度生存网络。

Stemness landscape in LUAD and multi-scale gene extraction
研究首先对9例患者的14,241个上皮细胞应用CytoTRACE2，细胞水平分析显示MIA/IAC阶段的CytoTRACE2评分显著高于AIS阶段（p < 0.001），但患者水平的中位数比较未达统计学显著性（Kruskal–Wallis p = 0.587）。在Bulk转录组水平，mRNAsi评分在肿瘤组织中显著高于配对癌旁组织，且与更短的疾病特异性生存期（DSS，disease-specific survival）、无进展间隔期（PFI，progression-free interval）及无病间隔期（DFI，disease-free interval）相关。研究人员从单细胞分析中鉴定出231个干细胞相关基因（scStemSig，single-cell stemness signature），从Bulk分析中鉴定出225个基因（BulkStemSig，bulk stemness signature）。

Construction and functional annotation of the IAPS
研究人员将单细胞与Bulk候选基因合并去重后生成453个基因的候选池，通过ORA利用StemChecker数据库和基因本体（GO，Gene Ontology）干细胞相关基因集精炼得到141基因的IAPS。功能注释显示IAPS富集于细胞周期进展和增殖相关通路，代表基因包括BIRC5和TOP2A。高IAPS组表现出显著较低的ESTIMATE评分，且与调节性T细胞（Treg，regulatory T cell）浸润及M2/M1巨噬细胞比值呈正相关，呈现免疫抑制表型。预后分析表明，高IAPS评分与更差的OS、DSS、PFI及DFI显著相关，该关联在调整年龄、性别和病理分期后仍然显著，并在外部验证队列中得到重复。与15基因肿瘤增殖率（TPR，Tumor Proliferation Rate）特征的相关性极强（Spearman ρ = 0.958），在调整肿瘤纯度和临床协变量的多变量Cox分析中，IAPS与TPR共同评估时仍保持与OS的显著关联。

IAPS is associated with immunosuppressive features and demonstrates consistent prognostic associations across multiple cohorts
IAPS评分在肿瘤组织中显著高于配对癌旁组织，在单细胞水平富集于活跃分裂的上皮和肿瘤细胞亚群。IAPS与年龄、性别、吸烟史、病理分期、mRNAsi及肿瘤突变负荷（TMB，tumor mutational burden）等关键临床和基因组特征相关。在226例具有驱动状态注释的GSE31210肿瘤中，IAPS评分在KRAS突变型肿瘤中显著高于EGFR突变型（BH-adjusted p = 0.0078），该差异在调整年龄、性别和分期后仍然显著（p = 0.0036）。

Spatial characterization of IAPS and its associations with metabolic pathway activity
空间转录组学分析显示，IAPS评分在肿瘤富集区域呈现异质性但一致性的肿瘤相关分布。在合并的斑点水平分析中，IAPS评分随AIS、MIA和IAC阶段递增（p < 0.001），且肿瘤富集区域高于非肿瘤区域。IAPS与糖酵解活性呈正相关（Spearman ρ = 0.36，ρ² = 0.13），与氧化磷酸化（OXPHOS，oxidative phosphorylation）呈负相关（ρ = ?0.20，ρ² = 0.04；两者均p < 0.001）。调整增殖评分后的分节特异性部分相关分析显示，ST1（部分ρ = 0.328，BH-adjusted p < 0.001）和ST2（部分ρ = 0.069，BH-adjusted p = 0.0148）中存在显著的IAPS-糖酵解关联，其余四个节段的糖酵解关联及OXPHOS关联在多重检验校正后衰减。

DeepHit radiomics model for non-invasive IAPS-anchored risk stratification
从影像组学训练集中提取的高通量影像组学特征，经IAPS相关性筛选和LASSO Cox回归降维后保留9个核心特征，主要包括一阶强度统计量和高阶纹理特征，未选择形态学或体积特征。基于这9个特征的DeepHit模型在独立医院验证队列中达到C-index 0.793（95% CI: 0.686–0.899），3年和5年时间依赖性受试者工作特征曲线下面积（AUC，area under the curve）分别为0.810和0.811。该模型在训练队列中的C-index为0.705（95% CI: 0.652–0.759）。Kaplan-Meier分析证实，在训练队列（log-rank p < 0.001）和验证队列（log-rank p = 0.005）中，模型预测的高风险患者均表现出显著更差的OS。与pT+pN Cox模型（C-index = 0.605）、临床Cox模型（C-index = 0.624）及未锚定的影像组学LASSO-Cox模型（C-index = 0.643）相比，DeepHit模型在独立验证中表现出显著优势（相对于pT+pN模型ΔC = 0.188，p = 0.028；相对于临床模型ΔC = 0.168，p = 0.046）。在探索性算法基准中，DeepHit的验证C-index估计值亦高于Cox回归（0.548）、随机生存森林（0.690）和DeepSurv（0.627）。

讨论部分，研究人员指出本研究通过整合scRNA-seq轨迹分析与多队列Bulk转录组学，开发了IAPS并将其转化为非侵入性DeepHit影像组学模型。该模型在独立验证中取得了C-index 0.793的强预后表现，仅使用常规CT影像即可进行风险分层，无需额外的侵入性组织分子分型。功能分析将IAPS与增殖活性、免疫抑制肿瘤微环境特征及代谢通路活性相关联，空间转录组学分析确定了在肿瘤富集区域中与糖酵解通路活性的正向关联（ρ = 0.36）和与氧化磷酸化的反向关联（ρ = ?0.20）。研究人员强调，这种分子层面信息的影像组学策略提供了生物学背景，而无需假设影像特征直接测量特定转录状态。DeepHit模型的应用能够捕捉影像组学特征与生存结局之间的非线性关系，且不依赖比例风险假设。研究同时承认存在若干局限性：样本量相对较小且为回顾性设计，可能限制普适性；当前研究侧重于转化评估而非机制性探索，对候选IAPS基因如BIRC5和TOP2A的功能验证及独立组织确认仍是重要方向；10x Visium的55微米分辨率可能无法完全解析单细胞异质性，更高分辨率的空间技术如Xenium或CosMx可进一步优化空间图谱绘制。最后，多中心前瞻性验证对于确立该建模框架的普遍适用性至关重要。

研究结论部分，本研究表明，将侵袭相关增殖特征（IAPS）与深度生存建模相整合，可为肺腺癌（LUAD）的非侵入性预后预测提供潜在价值。141基因IAPS反映了与增殖、代谢通路活性及免疫抑制性肿瘤微环境相关的分子特征。通过将影像组学特征选择锚定至这一经生物学特征描述的转录程序，DeepHit模型在独立临床验证队列中利用常规CT影像单独达到了0.793的一致性指数（C-index），无需额外的侵入性组织分子分型。这些发现支持了分子层面信息影像组学在LUAD非侵入性风险分层中的潜在价值，并为个体化围术期管理提供了依据，有待进一步的多中心前瞻性验证。