《Neoplasia》：Single-cell analysis of epithelial transcriptional states identifies stromal associations and candidate targets in colon cancer
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背景：结肠癌进展涉及上皮细胞与肿瘤微环境的协同变化，但上皮细胞状态的转录组织方式、相关调控程序及候选易感靶点仍不明确。方法：研究人员整合多队列单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，并结合推断性拷贝数变异（CNV）、拟时序、调控子（regulon）及空间转
背景：结肠癌进展涉及上皮细胞与肿瘤微环境的协同变化，但上皮细胞状态的转录组织方式、相关调控程序及候选易感靶点仍不明确。方法：研究人员整合多队列单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，并结合推断性拷贝数变异（CNV）、拟时序、调控子（regulon）及空间转录组分析；通过配体–受体互作推断表征状态相关通讯；采用基于Geneformer的计算机模拟扰动、虚拟筛选及分子动力学模拟提名候选分子以供功能研究；在HCT 116细胞中通过EdU、细胞周期、凋亡及迁移/侵袭实验评估ZC3HC1敲低、过表达与回补效应；采用多重免疫荧光检测肿瘤切片中上皮与免疫标志物分布；基于TCGA-COAD内部嵌套筛选构建上皮状态信息预后模型，并以固定训练阈值在GEO队列中评估。结果：上皮细胞形成三种具有不同表达与调控程序的转录状态；State 3富集ILF2、NFYB、MLX、CTCF与HMGA1相关调控子；成纤维细胞为主要信号来源，T细胞传入通讯强度最高，State 3显示候选CypA、COLLAGEN与CD99表达关联，空间分析进一步显示胶原配体与SDC1、SDC4、CD44及整合素受体复合物共现；HCT 116细胞中ZC3HC1敲低降低EdU掺入、增加G0/G1期蓄积与凋亡、减弱迁移与侵袭，回补部分恢复上述表型；多重染色显示PanCK阳性区域周围髓系与T细胞分布存在对比；虚拟筛选提名DB12168为候选ZC3HC1结合化合物；上皮状态信息风险模型显示队列依赖性预后表现，其与免疫排斥及血管生成的关联为探索性。结论：结肠癌上皮转录状态与不同调控程序及基质表达模式相关；功能实验提示ZC3HC1参与HCT 116细胞表型，虚拟筛选提名DB12168供结合研究，上皮状态信息风险模型为回顾性预后评估提供框架。
研究背景：结肠癌是异质性显著的疾病，组织病理学特征相似的肿瘤可出现明显不同的临床病程与系统治疗反应。大规模基因组研究与共识分子分型表明，这种差异反映肿瘤内在信号、基质活化与抗肿瘤免疫的不同；但大块组织检测平均了恶性、免疫与基质各隔室的信号，只能间接反映伴随肿瘤进展的细胞程序。单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过解析恶性上皮状态与多样肿瘤微环境群体显著细化了这一认识，空间图谱则显示这些群体的组织方式本身具有临床相关性。既有研究提示结肠癌更宜理解为动态多细胞生态系统。然而仍存在若干空白：多数单细胞图谱描述细胞组成或离散分子亚型，上皮转录状态沿潜在连续谱的排序尚未完全厘清；遗传多样化、转录可塑性与微环境选择可同时发生，仅凭静态表达谱难以区分不同细胞状态；推断性拷贝数变异（CNV）、转录轨迹与临床结局的联合分析鲜少整合为统一模型；状态相关调控程序难以仅由差异表达识别；何种基质群体与配体–受体轴与特定上皮转录状态相关仍不清楚。为此，研究人员整合多队列单细胞转录组数据与推断性CNV、拟时序排序、调控子分析与空间转录组，刻画上皮转录状态及其微环境背景，并结合计算机模拟基因删除与网络扰动分析评估候选调控因子，进而开展功能与结构筛选，并将状态相关程序纳入预后模型。
关键技术方法：研究整合四套公共结肠癌单细胞队列（GSE200997、GSE273567、GSE280312、GSE289314）构建图谱，以TCGA-COAD（结肠腺癌）建模，并在GSE38832、GSE39582、GSE17536、GSE161158、GSE106584及预设的GSE103479中再评估；以IMvigor210（阿替利珠单抗治疗的尿路上皮癌）作为探索性跨癌种免疫微环境参照；ZC3HC1肿瘤–正常表达比较使用GTEx–TCGA联合资源及多套GEO数据集。主要技术包括Seurat/Harmony单细胞处理与CellTypist注释、inferCNV拷贝数推断、Monocle 2拟时序、SCENIC/AUCell调控子分析、CellChat与SpatialCellChat通讯推断、RCTD空间解卷积、Geneformer计算机模拟扰动与scTenifoldKnk网络敲除、HCT 116细胞功能实验、基于结构的虚拟筛选与分子动力学模拟、嵌套机器学习预后建模及多重免疫荧光。
研究结果：
整合单细胞图谱解析结肠癌细胞生态系统：质控、批次校正与整合后无监督聚类得到30个转录簇，归并为上皮、内皮、成纤维、肥大、巨噬、T、B与浆细胞八类主要谱系；各谱系丰度在标本间存在差异，采样与解离等技术效应可能参与其中。
CNV结构与拟时序刻画三种上皮转录状态：CNV评分在上皮亚簇间存在差异；轨迹推断将上皮细胞排布为分支转录连续谱，并据此划分State 1、State 2与State 3；状态前缀CNV亚组标签系在各状态内独立构建，故仅作描述性解读；以正常上皮参比的患者配对比较未显示RNA-CNV负荷沿三状态递增；状态特异基因富集于细胞周期调控、线粒体与生物合成、蛋白定位、凋亡、细胞黏附与细胞连接组织等过程；三状态与显著不同的结局相关，State 3生存最差、State 1最佳、State 2居中。
State 3具有独特调控子程序：调控子活性相关聚类得到14个调控子模块（M1–M14），State 1优先关联含POU3F1、IRF7、NR5A2与MZF1的模块，State 2关联ERG、NFE2与TBX15，State 3关联含ILF2、NFYB、MLX、CTCF、HMGA1、EN1与DLX6的模块；将State 3相关调控子投射至轨迹显示CTCF、HMGA1、ILF2、NFYB、MLX等活性沿State 3分支优先升高，平滑活性随拟时序上升并在State 3区域达峰。
State 3接受显著的成纤维细胞来源与细胞外基质信号：细胞通讯分析显示成纤维细胞总体传出通讯最强，T细胞传入强度最高，State 3传入强度低于T与B细胞；以State 3为靶群体识别出PPIA–BSG、CD99–CD99、MIF–CD74/CD44与COL1A2–SDC4等互作；成纤维细胞至State 3通讯以COLLAGEN、LAMININ与FN1等细胞外基质通路为主，免疫群体贡献CypA、CD99等信号；空间转录组显示估计的上皮状态分数占据不等价空间区域，COL1A1或COL1A2与SDC1、SDC4、CD44、ITGA2–ITGB1及ITGA3–ITGB1呈现区域性共现。
计算机模拟扰动优先提名ZC3HC1为State 3候选调控因子：基于Geneformer的模拟敲除筛选以余弦相似度量化偏离State 3并趋向State 1的位移，随机基因敲除作零假设对照；ZC3HC1在原输出中显示由State 3向State 1的位移，在目标状态位移中排名第928位、在联合位移中排名第1,073位；ZC3HC1在结肠肿瘤中相对非恶性组织表达升高，438例TCGA-COAD固定表达分组的总生存log-rank P=0.0043；网络扰动分析显示全基因组扰动Z分数分布广泛但不均一，IGHA1、IGKC、TUBA1B、IGHA2、PTMA、STMN1等受影响显著；HCT 116细胞中两种shZC3HC1构建均降低48小时EdU阳性核比例，过表达增加EdU掺入，回补部分恢复；敲低增加G0/G1比例、减少S期、增大Annexin V阳性比例，过表达呈相反模式，回补使分布回归对照；敲低减少Transwell迁移与侵袭细胞数、划痕残留间隙增宽，过表达相反，回补部分恢复。
基于结构的筛选识别候选ZC3HC1结合化合物：筛选流程包括DrugBank库制备、分子过滤、受体准备、五个候选结合口袋识别、五口袋平行对接、命中聚合、高穷尽度重对接与100 ns分子动力学模拟；DB12168对接于确定口袋，候选接触残基包括Asp356与Asn362；模拟中配体与口袋RMSD在初始平衡后相对受限，回转半径在初始阶段后稳定，蛋白–配体氢键与原子接触持续存在但随时间变化；DB18725、DB11925与DB11791以同一框架评估，DB12168被提名为供ZC3HC1结合研究的计算候选物。
上皮状态信息模型在多队列中评估：生存模型比较评估101种算法及组合，热图汇总各队列一致性指数及全部队列与评估队列的平均表现；Kaplan–Meier曲线显示TCGA-COAD、GSE39582、GSE161158、GSE38832、GSE17536与GSE106584中高、低风险组生存分离呈队列依赖；森林图汇总各队列单因素Cox估计及固定与随机效应合并估计；将结局相关特征与模型选择限定于TCGA-COAD训练分区的嵌套评估C指数为0.593（95% bootstrap区间0.532–0.662）。
上皮状态信息风险评分与免疫特征的探索：整合基因组图谱展示高、低风险组的肿瘤突变负荷、突变特征贡献、复发体细胞突变与拷贝数改变；评分与抑制性或刺激性免疫检查点基因的相关性提供互补表达视角；IMvigor210中按反应类别汇总评分分布、按高/低分组展示生存及反应类别比例，该队列仅作跨癌种免疫微环境参照；免疫排斥与血管生成评分在高、低风险组间比较，多种解卷积方法显示基质与免疫细胞估计的变异；四例独立病例、每例两个标志物面板共八张切片的 múltiplex免疫荧光显示，一张代表性切片PanCK阳性区域内外CD68阳性髓系浸润显著而CD3、CD8阳性淋巴细胞稀疏，另一张则CD3、CD8阳性淋巴细胞浸润较多并伴更明显PD-1与PD-L1信号，CD19、CD56与FOXP3阳性细胞在展示视野中相对稀疏。
讨论与结论：三状态架构补充了既往结直肠癌单细胞分型，但拟时序不直接记录祖先关系，推断性CNV分辨率不及单细胞DNA测序，故状态应解释为转录构型而非已证实的克隆谱系。调控子分析提供超越状态标志物表达的活性层面，State 3相关活性升高描述协调活动模式而非证明因果性状态维持；按位移方向与幅度排序的扰动分析明确询问哪些删除可能改变State 3嵌入。计算机模拟扰动为功能测试提供优先级框架，HCT 116中的扰动与回补实验评估了增殖、细胞周期、凋亡与迁移相关表型，State 3富集的类器官与谱系分辨模型可提供状态特异性检验的互补情境。State 3处于独特微环境背景，CypA、COLLAGEN与CD99信号显著参与其传入通讯，空间分析描述胶原配体与SDC1、SDC4、CD44及整合素受体复合物共现，提示细胞外基质信号可能与上皮表达程序相关，并提出 niche 受体共同参与可能影响状态稳定性的可检验假设。ZC3HC1虚拟筛选示例了从计算提名调控因子到可操作化学假设的路径，DB12168具稳定预测结合构型与持续蛋白–配体接触，仍需生物物理结合、热位移或细胞靶点占据、剂量反应与构效优化实验评估。将单细胞发现转化为大块组织风险评分提供互补临床检验，因五个GEO队列参与101种模型配置选择，其结果视为队列再评估；训练限定嵌套选择C指数0.593，临床终点分别评估，合并森林图在终点异质性背景下解读。IMvigor210提供跨癌种探索性背景，其为转移性尿路上皮癌数据而非结肠癌试验，不能确立模型预测结肠癌检查点阻断获益，需在前瞻性免疫治疗结直肠癌队列（尤其错配修复缺陷与微卫星高度不稳定疾病）中验证。局限性包括：整合不同平台、采样方案与临床注释的公共数据，残余批次效应与队列混杂仍可能存在；恶性判定、CNV谱、调控子活性与细胞通讯均为计算估计，需正交实验确认；回顾性生存建模易受治疗、分期分布与随访差异影响，部分外部队列判别力仅中等；本研究亦无法确定ZC3HC1是否在所有结肠癌分子亚型中必需，或仅在富集State 3的肿瘤中必需。结论译文：本研究刻画了结肠癌上皮转录状态，并将State 3与相关调控子活性及成纤维细胞相关表达模式相联系。HCT 116实验将ZC3HC1扰动与增殖、存活及运动性相联系，虚拟筛选提名DB12168供结合研究，风险模型为评估细胞状态生物学的临床关联提供回顾性框架。更广泛而言，该工作支持将上皮表达状态与空间共现及扰动假设联合分析的策略；前瞻性空间图谱、谱系分辨模型与直接靶点验证将确定干扰State 3程序或其基质支持能否改变临床相关表型。
