《The Plant Genome》：Integrated transcriptomic and metabolite analysis reveals the role of AktADT8 in the biosynthesis of phenylalanine and its derivatives in Akebia trifoliata
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芳香族氨基酸脱氨酶（ADT）是植物苯丙氨酸（Phe）生物合成中的关键酶，为蛋白质和酚类化合物提供前体。三叶木通因其富含Phe及其衍生物而被视为药用、水果和观赏植物。在先前鉴定的373种代谢物中，有135种是酚类化合物。此外，对来自9个BioProjects的5
芳香族氨基酸脱氨酶（ADT）是植物苯丙氨酸（Phe）生物合成中的关键酶，为蛋白质和酚类化合物提供前体。三叶木通因其富含Phe及其衍生物而被视为药用、水果和观赏植物。在先前鉴定的373种代谢物中，有135种是酚类化合物。此外，对来自9个BioProjects的53个样本的153个转录组数据集的分析显示，AktADT3和AktADT8表现出明显的阶段特异性表达模式。在AktADTs中共检测到758个突变位点，其中AktADT8的同义变异比例显著更高。共表达分析表明，AktADT转录本丰度与五种类黄酮生物合成途径中的124种代谢物和150种酶编码基因的水平显著相关，其中AktADT8在所有途径中均显示出广泛的积极相关性。在拟南芥转化株系中过表达AktADT6和AktADT8后，Phe和类黄酮含量显著增加。此外，AktADT8具有两个独特的转录起始位点，结合预测表明MYB105（v-myb禽成髓细胞瘤病毒癌基因同源物）可结合到AktADT8的启动子区域，而MYB21则可结合到AktADT8和AktADTs8两者的启动子区域，从而调控其转录活性。这些发现凸显了AktADT8是三叶木通Phe代谢中的一个关键候选基因。
研究背景与科学问题
苯丙氨酸（Phe）是植物中苯丙烷类多酚（如木质素、类黄酮和花青素）的核心前体，其生物合成是植物次生代谢的关键调控节点。在植物中，Phe的合成主要通过两条途径：位于叶绿体的分支酸途径（arogenate pathway）和位于胞质的苯丙酮酸途径（phenylpyruvate pathway）。芳香族氨基酸脱氨酶（ADT）是分支酸途径中的关键酶，而部分ADT还具有预苯酸脱羧酶/脱水酶（PDT）活性，可催化苯丙酮酸途径的第一步反应。
三叶木通是一种多年生木质藤本植物，广泛分布于东亚、欧洲和北美，在中国作为药材已有超过2000年的历史，因其富含Phe衍生的生物活性次生代谢物（尤其是类黄酮）而备受关注。此前研究发现，三叶木通ADT家族包含8个成员，其中AktADT4、AktADT7和AktADT8具有双重ADT/PDT活性，且AktADT8属于γ型ADT，拥有两个转录起始位点（TSS1和TSS2），分别编码定位于叶绿体（AktADT8）和胞质（AktADTs8）的蛋白。然而，AktADT8如何参与Phe生物合成、代谢流分配以及下游多酚积累的具体机制仍不清楚。
研究方法概述
研究人员收集了三叶木通所有已发表的代谢物和转录组数据集。从Web of Science检索到132篇相关文献，统计整理了2347种代谢物，其中373种在多个出版物中被报道。同时，从NCBI和CNCB-NGDC数据库获取了9个BioProjects共153个转录组数据集（51个样本，每个样本三个生物学重复），样本覆盖中国大部分亚热带地区，包括湖南、四川、贵州、云南、安徽等省份的叶片、果皮、果肉、种子和全果组织。利用HISAT2将clean reads比对至参考基因组，StringTie评估基因表达水平，BCFtools鉴定变异位点，SnpEff进行功能注释。通过SPSS进行AktADT8表达与类黄酮化合物及酶编码基因的相关性分析。采用PlantCARE和TBtools预测顺式作用元件和转录因子结合位点。通过农杆菌介导的花序浸染法将AktADT1-8在拟南芥中过表达，测定Phe和总类黄酮含量。最后，利用双荧光素酶报告基因实验和酵母单杂交（Y1H）实验验证MYB21和MYB105对AktADT8和AktADTs8启动子的调控作用。
研究结果
3.1 三叶木通代谢物的荟萃分析：从132篇文献中统计到2347种代谢物，其中373种被多次报道。在这些多次报道的代谢物中，191种为次生代谢物，其中酚类化合物135种，占次生代谢物的70.68%。不同果肉样本中Phe含量差异较大，范围为6.98至405 μg/g。
3.2 三叶木通转录组测序数据与基因注释：共获得1149.4 Gb原始测序数据，经质控得到1067.46 Gb clean data。各样本GC含量为41%-48%，比对率为68.54%-94.51%。PRJNA884501数据集鉴定到的基因数最多（34102个），PRJNA524995最少（20423个），17340个已知基因在所有九个数据集中共有。
3.3 相关性分析与序列变异检测：同一组织样本间高度正相关，不同组织间弱正相关。主成分分析显示PRJNA1098036（叶片）和PRJNA884501（种子）与其他数据集分离。共鉴定到12,821,723个变异位点，其中92.88%为单核苷酸多态性（SNP），插入（INS）和缺失（DEL）分别占4.10%和3.02%。基于遗传距离的系统发育树显示，四川样本与参考基因组遗传距离最近，湖南样本最远。
3.4 各样本中AktADTs的表达谱与序列变异：AktADT1、AktADT2和AktADT5表达普遍较低，AktADT6持续高表达，AktADT3和AktADT8呈现明显的阶段特异性表达模式。AktADT3在幼果果皮和果肉中高表达，AktADT8在种子发育早期高表达，且其表达与病害感染和盐碱胁迫相关。共检测到758个变异位点，其中AktADT6变异最多（208个），AktADT3最少（9个）。AktADT8的编码区（CDS）中同义变异比例最高。
3.5 AktADTs与Phe代谢途径代谢物及酶基因的相关性分析：利用PRJNA671772数据集的36个样本进行关联分析，发现AktADT基因与124种代谢物和150个酶编码基因显著相关，涉及五种类黄酮生物合成途径。只有AktADT7和AktADT8与每条途径中的代谢物和基因均显著相关。其中，AktADT8与49个基因和34种代谢物显著正相关，13种代谢物被多次报道。
3.6 过表达AktADTs的拟南芥表型分析：AktADT5过表达植株出现叶片卷曲、锯齿状边缘和发育延迟。AktADT8过表达植株抽薹和开花显著提前。AktADT6和AktADT8过表达植株的Phe和类黄酮含量显著高于野生型，其中AktADT8过表达植株的Phe含量几乎翻倍。
3.7 AktADT8和AktADTs8调控网络的假设：在所有51个样本中，AktADT8的read数均高于AktADTs8。预测到AktADT8和AktADTs8的启动子区域分别含有286和243个转录因子的结合位点，其中231个共有。MYB105和MYB21被预测可结合到核心启动子区域。共表达分析显示两者与AktADT8和AktADTs8的表达均显著正相关。分子对接模拟显示了MYB21和MYB105蛋白与核心启动子区域预测序列的氢键相互作用。
3.8 MYB21和MYB105通过直接启动子结合差异调控AktADT8和AktADTs8：双荧光素酶报告基因实验表明，MYB21和MYB105均显著增强AktADT8启动子活性约2.0倍；MYB21显著增强AktADTs8启动子活性约1.5倍，而MYB105无显著影响。Y1H实验进一步证实，MYB21和MYB105均可结合AktADT8pro，但仅MYB21可结合AktADTs8pro。
讨论与结论
讨论部分指出，三叶木通的药用和营养价值可能主要与其丰富的酚类化合物（尤其是类黄酮）有关，而非萜类和生物碱，这与其他药用植物（如人参和附子）不同。AktADT8作为γ型ADT，对Phe反馈抑制不敏感，维持较高催化活性，这可能解释了其对Phe积累和类黄酮生物合成的显著促进作用。AktADT8通过两个TSS产生的两种转录本（AktADT8定位于叶绿体，AktADTs8定位于胞质）可能在不同发育和环境条件下提供代谢灵活性。MYB21可激活两个转录本的启动子，而MYB105特异性激活AktADT8，这种差异调控可能源于结合位点在核心启动子区域的位置差异。
研究结论：本研究鉴定出135种Phe衍生的多酚化合物，占多次报道次生代谢物的70.68%，这可能有助于三叶木通的药用价值和环境适应性。遗传学上，丰富的多酚可能与AktADT8的功能相关，该基因参与Phe的生物合成途径，这一点得到了拟南芥过表达株系的表型变化、表达谱、序列变异和共表达网络分析的支持。功能上，预测有135个转录因子可结合到AktADT8和AktADTs8的启动子区域并与它们的表达模式显著相关。其中，MYB21被实验证明可激活AktADT8和AktADTs8两者的转录活性，而MYB105则特异性激活AktADT8。这些发现为提高Phe及其衍生物的生物合成途径提供了通用策略。
