《Cancer Medicine》：A Period of Grace: Suppression of Malignancy During Embryonic Life
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在胚胎期，尤其是器官发生（organogenesis）阶段，通过实验诱导癌症的发生显著困难。基于此现象及宫内（intra-uterine）生命期肿瘤发生的其他相关特征，研究人员提出假说：胚胎发生（embryogenesis）过程中存在主动抑制恶性肿瘤（mali
在胚胎期，尤其是器官发生（organogenesis）阶段，通过实验诱导癌症的发生显著困难。基于此现象及宫内（intra-uterine）生命期肿瘤发生的其他相关特征，研究人员提出假说：胚胎发生（embryogenesis）过程中存在主动抑制恶性肿瘤（malignancy）发展的因子。本文综述了当前支持该假说的证据，同时回顾了胚胎组织提取物（embryonic tissue extracts）在体外（in vitro）和体内（in vivo）对癌细胞作用的已有数据，并探讨了其潜在的治疗意义。
**1 引言**
实验数据明确显示，胚胎发生过程中癌变（carcinogenesis）受到抑制。最具说服力的证据是，通过辐照或经胎盘（transplacental）化学致癌作用在早期动物胚胎中诱导癌症的尝试大多未能成功，即使受暴露动物被观察至终生。相反，存活的后代以高畸形率出生。在妊娠后期，动物迅速变得对癌变敏感。同等重要的是，当恶性肿瘤细胞被移植到胚胎中时，它们经常丧失恶性特征，甚至可整合入生物体并参与其正常发育。这些数据连同胚胎和胎儿期肿瘤发生的其他方面，促使作者之一在1983年提出：胚胎发生过程中存在的因子具有抑制恶性肿瘤发展的作用。1991年发表了后续文章，聚焦于产前辐照对癌症发展的影响。尽管人类出生时患癌或在出生后28天内发生癌症极为罕见，但由于明显缺乏实验数据以及若干统计和流行病学混杂因素，在人类中记录这种肿瘤抑制作用更具挑战性。然而，现有的人类数据并不矛盾，反而支持早期胚胎生命期存在癌症抑制的结论。1983年假说基于以下发现：不到十万分之四的人类出生时患有癌症或在出生后第一个月内发生癌症；在自然流产的胚胎或胎儿中极其罕见发现恶性肿瘤；尽管约千分之一的孕妇患有母体癌症，但母体癌症转移至胚胎的报道极少；对广岛和长崎原子弹爆炸幸存者的50岁随访显示，产前暴露与出生后至6岁暴露的两个群体均呈现统计学显著的剂量相关实体瘤风险增加，但出生后暴露者的风险比宫内暴露者高10倍；通过辐照或经胎盘化学致癌作用在早期动物胚胎中诱导癌症的尝试相对不成功；实验诱导早期恶性肿瘤的困难不能通过自然流产导致的肿瘤易感群体丢失来解释；当细胞从胚胎环境中取出后易于转化，因此对肿瘤发展的抗拒性不能主要在单细胞水平解释；恶性细胞移植到胚胎后常丧失恶性特征；在两栖类中，将恶性肿瘤移植到再生肢体或对化学诱导肿瘤远端进行截肢，多数情况下导致肿瘤分化和自发消退；人类所谓的胚胎性肿瘤主要在出生后前4年发生，由未成熟组织构成，但尽管具有胚胎外观，最常见的胚胎性肿瘤（如Wilms瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤）发生于器官发生异常晚的器官中；儿童诊断胚胎性肿瘤时年龄越小（与白血病不同），预后通常越好；与成人癌症不同，胚胎性肿瘤的自发消退并非罕见发现，这些自发消退几乎从不发生在2岁以后。因此，早期胚胎生命期癌症的低发生率和明显抑制似乎归因于胚胎环境，而非胚胎细胞的内在特征。此外，胚胎肿瘤控制的主要机制——细胞分化和细胞死亡——与调控正常胚胎发育的机制相似。由此得出的结论是：癌症可能受与调控正常发育相似或相同的机制控制，这些机制在器官发生期间尤为显著和有效。
**2 肿瘤移植入胚胎微环境的补充研究**
20世纪70年代初，Brinster等人证明，当将一个小鼠品系的胚胎癌细胞转移到另一品系的囊胚中并植入假孕宿主子宫后，可产生正常的嵌合小鼠，其中原始恶性细胞参与了正常发育。尽管这表明胚胎环境具有控制和逆转恶性状态的作用，但癌细胞本身是胚胎性的且最初由移植的正常小鼠胚胎实验性产生，限制了对结果的更广泛解释。此后，多项研究表明，当成人癌细胞移植到胚胎中时，胚胎环境也可诱导已记录的逆转。例如，Lee等人显示，当人转移性黑色素瘤细胞移植到斑马鱼囊胚期胚胎中时，癌细胞真正逆转为非致瘤表型。黑色素瘤细胞存活并分裂但不形成肿瘤，然而它们并未整合入宿主器官，而是散布于胚胎中，居于间质空间。类似结果也在其他研究中获得，如将人黑色素瘤细胞移植到鸡或小鼠胚胎中。在一项与上述嵌合小鼠研究类似但使用非胚胎性肿瘤的研究中，Li等人将小鼠髓母细胞瘤的细胞核转移到小鼠去核卵母细胞中，然后将克隆的囊胚转移到假孕雌性中。尽管无胚胎发育至足月，但在第8天前发现存活胚胎，且无肿瘤形成证据。后来，Hochedlinger等人成功地从注入去核卵母细胞的黑色素瘤细胞核产生嵌合小鼠，这些卵母细胞用于生成胚胎干细胞，随后注射入囊胚。尽管嵌合小鼠的恶性肿瘤发生率高于对照，但其绝大多数组织正常，再次证明了胚胎微环境的肿瘤逆转效力。然而，移植时机具有相关性。Gootwine等人将髓系白血病细胞在妊娠第10天注入小鼠子宫内胚胎，产生了明显健康的成年小鼠，其粒细胞含有源自白血病细胞的标记。但当白血病细胞在其他妊娠时间注射时，未能实现此结果，其他研究组也在其他肿瘤中发现了类似结果。一种可能的解释是：生物体抑制癌症进展的能力在所涉组织受到最强调控和组织的时期以及在这些发育过程附近最为强大。总体而言，肿瘤细胞在胚胎环境中逆转为非肿瘤表型的能力在不同模型中已被证明随着发育的推进而降低。
**3 胚胎干细胞、胚胎提取物、卵母细胞提取物及脐带基质干细胞治疗肿瘤：体外研究**
研究已明确证明早期胚胎环境具有调控和逆转恶性状态的能力。问题在于其机制如何。为试图阐明这一宽限期（period of grace）背后的机制并评估未来治疗的潜力，已开展体外研究探讨胚胎因子和微环境对肿瘤细胞系的影响。例如，Liu等人将人葡萄膜黑色素瘤细胞系与小鼠胚胎干细胞共培养，发现黑色素瘤细胞的增殖和致瘤性受到抑制。He等人使用人胶质母细胞瘤细胞系获得了类似结果。Ayuzawa等人证明，易于获取的人脐带基质干细胞在与乳腺癌细胞共培养时也能抑制其生长。尽管一些证据表明胚胎干细胞微环境对肿瘤细胞的逆转依赖于细胞间接触，但其他体外和体内研究表明这未必如此。此外，胚胎提取物及可扩散物质在特定条件下也被证明具有诱导逆转和/或细胞死亡的能力。在一项早期研究中，将11至13天鸡胚胎的过滤提取物以不同浓度加入软琼脂糖中的A9细胞。在低浓度胚胎提取物下，细胞存活但不能形成集落，与阳性对照不同。在较高浓度下，A9细胞死亡。提取物的Sephadex分离产生了一个独特的抑制性组分。类似研究利用斑马鱼胚胎提取物和两栖类卵母细胞提取物对恶性细胞系进行了实验。Biava等人用不同阶段斑马鱼胚胎提取的因子处理多种肿瘤细胞系，发现使用除桑葚胚期外所有发育阶段提取的因子均可观察到肿瘤细胞生长速率降低。Allegrucci等人表明乳腺癌细胞可被两栖类卵母细胞提取物直接重编程，伴随DNA去甲基化和肿瘤抑制基因启动子处抑制性组蛋白标记的去除。Yang等人发现，当人前列腺癌细胞系与人胚胎干细胞共培养时，去除的上清液本身以浓度依赖性方式降低前列腺癌细胞的活力，表明在癌细胞刺激后分泌因子发挥作用。有趣的是，Seno等人发现了看似相反的效果：肺癌或黑色素瘤细胞的条件培养基具有将小鼠胚胎干细胞转化为癌症干细胞的能力。
**4 胚胎提取物治疗肿瘤：体内研究**
使用胚胎提取物尝试调节小鼠和大鼠肿瘤形成的体内研究结果较不一致，且发表的研究较少。然而，一些研究组已记录了相关效果。Liu等人将人葡萄膜黑色素瘤细胞注射到裸鼠中，约2周后在肿瘤环境中注射小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞条件培养基或生理盐水。三个治疗周期后检查肿瘤，干细胞治疗组小鼠的肿瘤远小于生理盐水组，而干细胞条件培养基治疗组仅略小。Ayuzawa等人将乳腺癌细胞移植到雌性小鼠中，8天后开始每周注射生理盐水或人脐带基质干细胞，共三次。所有小鼠均发生肺部肿瘤，但接受干细胞治疗的小鼠肿瘤生长显著减弱，免疫组化分析显示干细胞聚集在肿瘤组织周围。Biava等人将小鼠肺癌细胞皮下注射到雌性小鼠中，注射前将肿瘤细胞与9天龄小鼠胚胎匀浆、9天孕鼠子宫匀浆、非孕子宫匀浆或作为对照的肝脏匀浆混合。仅与孕鼠子宫匀浆混合的细胞未能形成肿瘤，而其他所有情况下均形成肿瘤及转移。另一方面，使用果蝇胚胎组织匀浆时可观察到肿瘤体积减小。使用斑马鱼胚胎的干细胞分化阶段因子也获得了阳性结果。Berger等人发现，当肝癌细胞注射到同系大鼠中时，用小鼠胚胎细胞核提取物预处理癌细胞可提高大鼠存活率。Yang等人将前列腺癌细胞皮下注射到小鼠中，发现肿瘤形成后，在肿瘤周围注射前列腺癌细胞与人胚胎干细胞共培养后收集的上清液可抑制肿瘤生长，这与注射生理盐水或单独培养的胚胎干细胞上清液的结果不同。Bischof等人发现，从胚胎小鼠乳腺间质分离的无细胞细胞外基质（ECM）也具有肿瘤抑制作用。当注射到小鼠乳腺肿瘤中时，ECM治疗组动物的肿瘤比对照组小44%。由于发表偏倚倾向于成功实验，这些发现的重要性难以确定。
**5 胚胎提取物治疗肿瘤：临床研究**
除实验性体内研究外，还进行了少量初步临床试验，用胚胎提取物治疗人类晚期恶性肿瘤。Livraghi等人对179例对常规治疗无反应的中晚期肝细胞癌患者进行了随机对照研究。患者被随机分配接受舌下含服50%外包期斑马鱼胚胎低分子量提取物或仅保守治疗作为对照。在胚胎提取物治疗组中，作者报告了20%的部分缓解率及部分病例的完全消退率，以及6个月后16%的疾病稳定率，而对照组94%出现疾病进展。基于早期结果，随机化被终止。在后续研究中，作者报告了这些结果的确认。此外，同一研究团队成员对经过大量预处理的晚期复发结肠癌患者进行了初步研究。患者被纳入接受多激酶抑制剂Regorafenib的挽救治疗试验，其中12例患者被进一步随机分配接受含斑马鱼胚胎提取物的配方联合Regorafenib治疗。12个月时，作者报告单独接受Regorafenib治疗者的生存率为33%，而接受联合治疗者的生存率为75%。这与其体外发现一致，即斑马鱼胚胎提取物可增强化疗药物对结肠癌细胞及乳腺癌细胞的效应。然而，在另一研究组进行的另一项随机试验中，将含斑马鱼胚胎提取物的配方与甲地孕酮在61例晚期肝细胞癌患者中进行比较，该研究发现甲地孕酮治疗比斑马鱼提取物提供更好的长期生存。另一研究组将斑马鱼胚胎提取物与激酶抑制剂Sorafenib联合用于治疗一例肝细胞癌，该例随后完全消退，但未确定各化合物对最终结果的相对贡献。总之，这些临床结果必须视为非常初步的，尚未经过彻底评估或验证。然而值得注意的是，至少对于一种成人癌症——高度恶性的急性早幼粒细胞白血病，在全反式维甲酸和三氧化二砷治疗后，通过分化和凋亡向良性状态的临床逆转已被清晰且一致地证明。尽管该案例未使用微环境因子，但它进一步证明了至少某些恶性肿瘤在临床环境中也可被强制分化为正常状态的能力。
**6 胚胎环境中肿瘤逆转的机制**
大量工作致力于阐明胚胎微环境所证实的肿瘤抑制效应背后的机制。首先，长期以来已知癌细胞与胚胎细胞共享显著特征——多能性和可塑性表型、不受限制的增殖、胚胎蛋白表达、上皮-间质转化等。此外，胚胎微环境在特定阶段可将肿瘤细胞重编程为正常表型而不损伤它们，这表明癌症发展可能是一个可逆过程，具有巨大治疗意义。对胚胎微环境处理后肿瘤细胞逆转过程的研究表明，恶性细胞可恢复看似完全正常的特征：正常分子通路的恢复、细胞周期阻滞、正常形态、正常细胞间粘附、上皮-间质转化下调、细胞骨架结构重塑、DNA甲基化逆转、肿瘤抑制基因启动子处抑制性组蛋白标记的去除，以及正常细胞发育的其他分子和形态学方面。然而，胚胎环境实际引导发育中生物体从多能性到正常分化的组织和器官的危险旅程并阻止恶性进展的确切机制仍部分笼罩在神秘之中。尽管体外研究表明胚胎细胞与癌细胞之间的细胞间或组织间接触是逆转的有益且有时必要的特征，但似乎也存在至少部分绕过此途径的方式。例如，Yang等人发现前列腺癌细胞系与胚胎干细胞共培养产生的分泌因子本身后来可引发逆转。在上述使用斑马鱼胚胎低分子量提取物治疗晚期肝细胞癌和结肠癌的小型临床试验中，显然没有细胞间接触。同时，作者本人写道：“很难理解为什么这些患者取得了如此显著的疗效。迄今为止，在斑马鱼胚胎的粗蛋白提取物或任何其他条件胚胎环境中，尚未鉴定出单一活性成分能够解释所观察到的药理效应。已进行了对抗癌因子的广泛搜索，但尚未提供结论性数据，胚胎相关抗癌分子效应物的鉴定仍是深入研究的课题。”
**7 讨论**
在此背景下，重要的是考虑终生肿瘤发生的一些总体方面：必须认识到癌症主要是一种衰老疾病。在人类中，癌症诊断在45-50岁之前相对罕见，此后发病率急剧上升，在75-80岁左右达到高峰，之后再次下降。这通常用该疾病最成熟的机制来解释，即细胞群体水平的类进化过程，由驱动基因突变的积累驱动，导致形成恶性肿瘤基础的细胞克隆选择。在常见的人类成人癌症中，如乳腺癌、前列腺癌和结肠癌，已得出结论：建立临床明显的肿瘤需要驱动基因和抑制基因中约10个或更多关键突变。积累这些突变显然需要时间，有时估计为数十年。然而一个有趣的观察是，80-85岁以后癌症发病率急剧下降，几乎无百岁老人患恶性肿瘤。解释各异，从高龄发病率记录的统计误差，到假设癌症易感者在85岁前已被诊断恶性肿瘤，再到老年人组织更新和细胞增殖程度较低。但对该有趣现象尚未达成共识。在新生儿和幼儿中，癌症全景与成人不同。年轻人的肿瘤似乎依赖较少的突变，并进一步受一系列增加癌症风险的遗传性种系突变影响。幼儿与成人发病高峰年龄之间的癌症发病率差异达数百倍。尽管存在这一巨大差异，新生儿癌症比0-5岁儿童低五倍，而在自然流产的胚胎或胎儿中几乎不存在。就恶性肿瘤而言，胚胎生命确实是一个真正的宽限期。当然可以争辩说早期胚胎的这一宽限期是尚未有时间积累足够突变的函数。但上述发现——移植到胚胎中的癌细胞丧失恶性表型、母体癌症不转移至胚胎、胚胎性肿瘤具有自发消退能力、在早期动物胚胎中诱导癌症的尝试即使终生观察也如此不成功——均反对胚胎对肿瘤发生的抵抗力是由于必要突变的缺乏或肿瘤发展时间不足。然而在人类中，关于胚胎期肿瘤起始和很久以后恶性转化的数据并非完全明确。某些类型的母体致癌暴露已被证明在一定程度上增加后代远期癌症发展的风险。研究最充分的例子是妊娠期母体使用己烯雌酚（主要发生在20世纪50和60年代），导致女儿在通常14-23岁时发生阴道透明细胞腺癌。然而腺癌发病率非常低，估计为0.14-1.4/1000，而其他阴道上皮改变如腺病的发生率高达34%。重要的是，在人类中，器官发生——似乎是最具肿瘤抵抗力的时期——主要发生在宫内生命的前2个月，而母亲通常在整个妊娠期接受己烯雌酚治疗。关于人类宫内辐射暴露的影响，最大且研究最充分的队列包括1945年在广岛和长崎原子弹爆炸中宫内暴露者。对产前暴露（2452人）和出生至6岁暴露（15388人）幸存者的50岁随访显示，两个群体均呈现统计学显著的剂量相关实体瘤风险增加，但出生后暴露者的风险比宫内暴露者高10倍。这再次表明宫内生命期的致癌打击比出生后的影响更为有限。在该研究中，未检测到不同孕期暴露之间风险有统计学显著差异。另一项对宫内暴露者的研究随访至67岁，聚焦于死因。关于致癌物的潜在多代效应以及遗传性种系突变的多代传递也有大量论述。也许最好的例子是易患遗传性视网膜母细胞瘤的种系突变，通常在生命第一年引起视网膜恶性肿瘤，外显率为80%-90%。从表面上看，这些肿瘤易感细胞在宫内生命期的存活似乎反对胚胎环境的肿瘤抑制作用。此外，有多个视网膜母细胞瘤患儿的母亲流产率并不高于正常，因此携带突变群体并未通过自然流产而减少。然而合理的结论是：单独的遗传异常——不表达恶性或其他异常表型——不一定足以触发肿瘤抑制。但不能排除存在多种机制的可能性。器官发生期间肿瘤发展的抑制是由于已转化细胞的逆转或消除，还是发生在更早阶段，即由于在细胞水平上防止癌症起始（例如防止第一个起始突变）？正如研究所证明的，大多数实验数据支持由于胚胎环境中存在肿瘤抑制因子而在组织水平发挥作用。然而也有数据支持在细胞水平防止突变，表明在持续活跃更新的组织中，体干细胞相对受到保护免受辐射和其他诱变剂的诱变诱导。这一效应尤其在毛囊干细胞和肠道干细胞模型系统中得到研究，似乎主要归因于增强的DNA修复功能。应注意，在某些生物体中，可证明的肿瘤抑制也可发生在成年期。如上所述，在成年两栖类中，将恶性肿瘤移植到再生肢体或对化学诱导肿瘤远端进行截肢，多数情况下导致肿瘤分化和自发消退。与此一致，Gersch指出再生能力高的动物物种肿瘤发生率相对较低。但在某些肿瘤发生率低的物种中可能存在其他机制。在裸鼹鼠中，恶性肿瘤抑制被认为归因于结缔组织中异常大的透明质酸分子。替代解释基于DNA修复或免疫抑制。在像大象和鲸鱼这样大的细胞丰富的动物中，肿瘤频率似乎也出乎意料地低。在大象中，这与肿瘤抑制基因p53的强基因拷贝扩增有关，而在鲸鱼中似乎存在肿瘤抑制基因的普遍扩增。其他值得注意的观察包括：尽管与结肠相比小肠增殖率很高，但成人小肠癌症发生率极低，而结肠也有高细胞更新率。一种解释是小肠和结肠之间微生物负荷的巨大差异，但确切机制仍不明确。要理解形态发生如何运作以及解剖稳态如何维持，需要阐明遗传决定的细胞硬件与多级组织的生理软件之间的联系。从此视角出发，不禁考虑导致癌症的大规模过程不仅仅是单细胞问题，而是系统水平细胞协调的紊乱。离子通道在细胞周围和组织水平产生的无处不在的电场是一种新兴机制，被认为在此系统水平运作。生物电介导的信息流连接细胞导致解剖学结果，这代表了一种有吸引力的形态发生控制系统。癌症可被视为细胞间通讯崩溃的后果，这种通讯使细胞能够联合成网络以进行大规模形态发生。
**8 结论**
早在19世纪，Virchow及后来的Cohnheim和Durante就提出恶性肿瘤代表细胞发育的异常形式，癌症起源于成人生物体中残留的胚胎组织。20世纪30年代，Waddington和Needham假设癌症代表对形态发生场的逃逸，类似于指导胚胎发育的形态发生场。20世纪70年代，多个研究组证明，当将一个小鼠品系的畸胎癌细胞转移到另一品系的囊胚中并植入假孕宿主子宫后，可产生正常嵌合小鼠，其中原始恶性细胞参与了正常发育。畸胎癌细胞本身是胚胎性的且最初由移植的正常小鼠胚胎实验性产生这一事实限制了对结果的更广泛解释。但文献中散布的其他研究确实提供了胚胎宽限期存在的指征——新生儿癌症发生率极低、早期胚胎中实验诱导癌症困难、胚胎细胞从胚胎环境取出后易于转化等——促使作者之一在1983年发表了假说：胚胎生命期尤其是器官发生期存在主动抑制癌症发展的因子。在随后的几十年中，进一步研究强化了这一结论：胚胎环境中的组分——其主要功能是引导发育中生物体从多能性和不受约束的增殖状态向分化和特化的组织和器官状态发展——也作为异常发育（即恶性肿瘤）的抑制剂发挥作用。大量研究表明，早期胚胎尤其在器官发生期间对恶性影响——无论是化学致癌物、辐射还是移植的恶性细胞——的反应是强制分化的受影响细胞或诱导细胞死亡。在发育后期，这种能力急剧减弱。事实上，同样的致癌剂在胎儿后期和出生后对存活后代将诱导大量恶性肿瘤，而在器官发生期间给药则产生畸形但无恶性肿瘤，这是发育早期强保护性形态发生场的直接证明。形态发生场当然终生存在，正如Bissell等人所证明的，微环境对出生后很久的组织更新以及肿瘤发展具有决定性影响。遗传改变远非肿瘤发生的唯一决定因素；环境至关重要。在某些情况下，环境甚至可诱导癌症。将正常上皮与致癌物处理的间质重组可导致上皮的恶性转化。但正常和异常生长的调控在生物体早期发育期间从未如此强大和有效。一生中肿瘤实际逆转的能力也从未如此显著。关键问题和挑战在于：胚胎环境中已证明的增强的肿瘤过程预防最终是否能够具有临床应用。胚胎因子可将恶性细胞重编程为无害细胞而不一定杀死它们，如果这些因子和机制能够被鉴定和利用，将具有巨大的潜在临床益处。
