《Regenerative Therapy》：Contamination spread within biosafety cabinets during wiping and its transfer to gloves: Quantitative assessment of cleaning risks
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细胞处理设施通常采用人工擦拭在生物安全柜（BSC）表面进行批次间清场时的去污染操作。尽管擦拭旨在去除污染物，但也可能无意中将污染物重新分布到表面各处或转移至操作人员手套上。关于擦拭技术、重复次数及表面材料对BSC内生物污染物扩散与转移影响的定量数据仍十分有限。
细胞处理设施通常采用人工擦拭在生物安全柜（BSC）表面进行批次间清场时的去污染操作。尽管擦拭旨在去除污染物，但也可能无意中将污染物重新分布到表面各处或转移至操作人员手套上。关于擦拭技术、重复次数及表面材料对BSC内生物污染物扩散与转移影响的定量数据仍十分有限。本研究系统评估了BSC内擦拭操作过程中污染的扩散情况，聚焦于DNA、蛋白质和活菌三种代表性指标。采用DNA、蛋白质和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）内生孢子作为模型指标，评估了污染物在不锈钢（SUS304）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面的重新分布。评估了两种擦拭方案：多次擦拭法（重复使用同一张擦拭布）和更换擦拭法（擦拭源区域后更换新擦拭布），每种方案分别在标准化机械条件下以乙醇润湿的非织造擦拭布执行1次或4次，条件基于EN 16615:2015。残留DNA和蛋白质采用荧光法定量（每种条件n=6），细菌表面污染通过接触培养法测定（每种条件n=12）。细菌向手套的转移在不同擦拭布数量递增条件下进行评估（每种擦拭布数量条件n=16）。结果：在所有条件下，DNA和蛋白质残留主要滞留于源区域，向邻近区域的转移极少。然而，即使在4次擦拭循环后，源区域仍可检测到可定量的残留。相比之下，活菌在多次擦拭法中易于重新分布至受影响区域，而在更换擦拭法中受影响区域的细菌检出频率较低。细菌向手套的转移随擦拭布数量增加呈单调递减（Cramér's V=0.82；Cochran–Armitage趋势检验，p=1.7×10?14）。结论：BSC内的擦拭操作既是去污染步骤，也是污染重新分布的潜在载体。这些发现为细胞处理设施实施更换擦拭策略、增加更换擦拭布频率以及将非微生物残留指标纳入清场验证提供了定量证据。
细胞处理设施本质上易受污染，尤其是来自环境微生物的污染，可能损害生物安全柜（BSC）内的无菌操作。细胞产品的制造高度依赖人工干预，移液、喷洒和擦拭是常规处理和清场程序中不可或缺的环节。这些依赖操作人员的活动增加了生物残留物（如来源于培养基或细胞的蛋白质、核酸和微生物）在工作表面持续存在的风险。因此，前一批次制造的残留污染可能持续存在并在严格洁净室条件下无意中影响后续操作，构成显著的生物学风险，包括潜在的意外免疫反应或移植细胞产品质量变异。现行标准和法规框架要求适当的清洁、消毒和污染控制程序。例如PIC/S GMP Annex 1要求受控的清洁和消毒方案，EN 13697和EN 16615提供了非多孔表面抗菌效力评估的标准化方法，USP <1072>涉及消毒剂选择及清洁/消毒方案的确认。日本GCTP要求同样强调细胞处理环境的适当污染控制程序。这些现有标准主要关注微生物污染（如细菌和真菌），而BSC清场过程中非微生物生物残留（包括细胞来源DNA和蛋白质）的具体可接受标准仍不明确。擦拭是去除BSC表面此类生物残留最广泛采用的实用方法之一，但其机械作用不仅可去除污染物，还可能无意中将污染物重新分布到表面各处或操作人员手套上。描述擦拭方法、重复次数和表面材料如何影响BSC内生物污染物扩散与转移的定量数据仍然有限。本研究系统评估了BSC内擦拭操作过程中污染的扩散情况，聚焦于DNA、蛋白质和活菌三种代表性指标。采用基于标准化测试方法改良的受控擦拭程序，定量评估残留污染及从限定源区域向邻近表面在不同材料类型和擦拭策略下的重新分布潜力。此外，研究人员检查了细菌向手套的转移作为操作污染风险的衡量指标。通过整合定量和定性评估，本研究旨在为BSC清场期间清洁相关风险提供循证依据，并为细胞处理环境制定更有效的污染控制策略提供信息。研究结果表明：DNA和蛋白质残留主要滞留于源区域，向受影响区域的转移极少；活菌通过多次擦拭法易于重新分布，而更换擦拭法可有效抑制；细菌向手套的转移随擦拭布数量增加而持续下降。这些结果提示擦拭操作不仅是去污染措施，也是污染重新分布的潜在载体，需要对视擦拭方法、频率和操作人员实践进行全面管理。非微生物残留（DNA和蛋白质）与活菌行为的差异值得关注。在受影响区域，即使反复擦拭后源区域仍存在残留信号，DNA和蛋白质污染仍接近阴性对照水平。一种解释是干燥的生物分子残留（如血清来源蛋白质和核酸）强烈吸附于非多孔表面，不易在醇润湿擦拭布产生的薄液膜中重新溶解，从而限制其向邻近区域转移。本研究中乙醇擦拭后蛋白质残留的持续存在与已知的乙醇诱导蛋白质固定现象一致。Costa等（2017）证明乙醇处理显著增加了手术器械上的蛋白质残留并阻碍后续清洁。乙醇使蛋白质变性和凝固，从而促进其粘附于金属表面。尽管醇类消毒剂（包括乙醇）是医疗保健和受控环境中最广泛使用的表面消毒剂，其杀菌效力已充分确立，但本研究发现表明乙醇擦拭可能对两个关键目标产生不同效应：微生物灭活和蛋白质去除。苯扎氯铵（BKC）和蒸馏水在去除蛋白质和DNA残留方面比乙醇更有效，提示细胞处理设施的清场程序应区分消毒擦拭和非微生物残留去除擦拭，并仔细考虑步骤顺序和清洁剂选择。值得注意的是，活菌比非微生物残留更容易通过擦拭布重复使用而重新分布。本研究采用枯草芽孢杆菌作为稳健的生物指示剂。鉴于醇类消毒剂在标准条件下缺乏杀孢子活性，观察到的结果主要反映机械转移而非化学灭活。枯草芽孢杆菌内生孢子对干燥、热、辐射和化学物质的抵抗力显著强于繁殖体细胞，被广泛认为是灭菌验证中的生物指示剂。因此，使用产孢微生物获得的结果可解释为对最具抵抗力污染物的清洁效率下限。这些发现与清场的实际场景一致，即乙醇擦拭尽管因其便利性和材料相容性而被广泛使用，但在没有补充杀孢子步骤的情况下可能无法完全应对产孢细菌。这些数据强调了制造过程中严格监测污染区域、确保彻底擦拭污染区域并防止污染扩散的重要性。此外，在制定生物安全柜清场程序时，应考虑消毒剂的抗菌谱和擦拭相关的转移动力学。繁殖体细菌通常比细菌内生孢子对乙醇更敏感。然而，微生物灭活不一定导致细胞物质的物理去除。灭活的繁殖体细胞及其细胞碎片可能表现类似本研究中检查的DNA和蛋白质残留，显示出有限的重新分布但持续存在于污染源区域。此类残留物质可能包括核酸、蛋白质以及革兰氏阴性菌情况下的内毒素，这些可能无法被乙醇擦拭充分去除。由于本研究未直接检查繁殖体细菌，此解释应在未来研究中确认。尽管本研究未设计用于检验材料间的差异，但此处观察到的描述性趋势与先前报道一致，即DNA去除效率可能因材料（如金属与塑料）而异并受所采用清洁策略的影响。材料表面特性（如粗糙度和表面能）影响细菌粘附能力。这些特性连同水分含量和清洁方案的具体细节，可决定污染物是被有效去除、保留在擦拭布中还是在表面间重新分布。观察到的SUS304和PET之间污染去除效率的差异可能源于表面物理化学特性（如润湿性、表面能和粗糙度）以及污染物回收效率的潜在差异。不锈钢通常表现出比PET更高的表面能，这可能促进蛋白质和细菌更强的初始粘附，而PET具有相对较低的表面能。这些材料特性可能为清洁结果的表面依赖性提供可能的解释，即PET倾向于显示出比SUS304更低的残留污染。由于材料未进行统计比较且其表面特性未直接测量，此解释应视为探索性的。此外，表观的材料依赖性差异可能受提取或回收效率变化的影响，而非污染物保留的真实差异。表面材料的影响还可能受污染物类型、干燥状态和所用清洁方法等因素的调节。鉴于本研究检查的条件范围有限，需要在更广泛的表面类型和环境条件下进行更广泛的验证，以制定可推广的材料选择建议。本研究还比较了两种擦拭方法：多次擦拭法和更换擦拭法。多次擦拭法与受影响区域内细菌扩散相关。相比之下，更换擦拭法下受影响区域的细菌阳性率在SUS304上显著低于源区域，而PET上的相应差异未达到统计学显著性。此差异可归因于污染物吸附到擦拭材料上随后转移到新表面的机械过程。这些发现与医疗保健环境中多模式环境清洁策略所倡导的"一布一区一方向"原则一致，强调了避免跨不同表面区域重复使用擦拭布的重要性。在自体细胞处理中，BSC工作表面上残留的前批次培养上清液或细胞碎片可能在清场擦拭过程中重新分布到先前未污染的区域。鉴于自体细胞产品含有患者来源的蛋白质和DNA，不同患者间的交叉污染构成显著质量风险，特别是关于移植后免疫反应和潜在未知病原体转移。连续四次擦拭循环后可检测到的DNA和蛋白质残留的持续存在凸显了机械去除的局限性。多种因素可能促成此现象，包括干燥污染物与表面粘附增加、乙醇诱导的蛋白质固定以及污染物在表面微观不规则结构内的物理保护。这些观察凸显了仅依赖乙醇擦拭的清场方案的局限性，并支持区分残留去除和微生物灭活的序贯策略。基于本研究发现和研究人员先前的研究，实用的BSC清场程序可根据需控制的污染性质组合若干互补步骤。初始残留去除步骤可涉及能够溶解生物残留的已验证清洁剂（如BKC基配方，在适当情况下），并频繁更换擦拭材料以最小化重新分布。随后可在必要时用水或另一种验证处理去除残留清洁剂，然后应用具有适当接触时间的验证消毒剂进行微生物灭活。乙醇作为最终消毒步骤可能特别有用，因为除了抗菌活性外，其高挥发性可最小化处理后工作表面上的残留消毒剂。在研究人员先前的研究中，紫外线照射在减少微生物污染方面高度有效，但对非微生物生物残留（如DNA和蛋白质）影响很小或没有影响。因此，紫外线照射可作为额外的微生物控制措施，但不能替代生物残留的物理去除。当产孢微生物污染构成相关风险时，还应将适当验证的杀孢子处理纳入设施特定的污染控制策略。重要的是，本研究中检查的污染水平代表了相对高的挑战条件，不太可能在正常细胞制造操作中常规出现。因此，上述多步骤程序不应被解释为所有设施普遍要求的标准操作程序。相反，每个设施应根据其特定污染风险、材料和制造过程建立可行方案，在常规细胞制造前通过确认或验证证明方案有效性，并通过基于计划-执行-检查-行动的污染控制计划持续审查和优化程序。手套污染与所用擦拭布数量之间的强相关性具有直接操作意义。手套是医疗保健和受控环境中公认的交叉污染载体。在某些环境中，接触污染表面构成手或手套污染的实质性风险，与直接接触患者相关的风险相当。本研究发现表明细菌阳性率随所用擦拭布数量增加呈明显的单调递减。这与"稀释/遏制"效应一致，即污染物被封存在丢弃的擦拭布中而非积累在操作人员手套上。这些发现建立在先前研究基础上，后者表明擦拭和去污染程序中使用的具体方法和材料显著影响二次污染风险。这些发现有两个实际意义。第一，污染的手套可在清洁后进行的无菌操作中作为二次污染源。Kpadeh-Rogers等报道即使手套去污染后细菌仍可能持续存在于手上，强调了通过手动接触导致手套表面污染的潜力。第二，从操作人员安全角度，在处理致病材料的设施中暴露风险尤其令人担忧。从程序角度看，本数据支持若干最佳实践：（i）频繁更换擦拭布，（ii）避免用可能受污染的擦拭布重新接触已清洁表面，（iii）实施手套卫生措施，如在清洁后更换手套或建立清洁与无菌操作之间的明确过渡方案。鉴于BSC随后用于无菌操作，即使短暂的手套污染若带入后续处理步骤也可能构成显著风险。此外，本研究识别了细胞处理设施当前清洁和消毒验证实践中的重要差距。现有方案通常主要关注微生物杀灭声明，而非微生物残留（如DNA和蛋白质，可能指示生物材料"携带"）未常规纳入可接受标准。在其他生物处理背景下，基于残留的评估（如蛋白质、核酸和产品相关杂质的特定检测）是清洁验证的基础。采用类似框架进行BSC清场可能是有必要的，特别是在处理涉及不同供体、培养基或补充剂的连续批次时。当前数据表明在测试条件下，DNA和蛋白质残留超出源区域的重新分布极少。然而，残留可能在多次擦拭循环后仍持续存在于源区域内，表明风险管理策略应优先考虑污染最严重的区域（如直接工作区）。增强残留溶解和去除的靶向清洁方案可进一步降低污染风险。此外，工作表面反复暴露于生物材料可促进持续性表面相关残留或生物膜样污染的积累，从而损害常规清洁和消毒程序的效力。本研究存在若干局限性。第一，细菌污染采用接触培养阳性而非定量回收评估，可能低估了低水平重新分布而强调了操作上有意义的污染存在或不存在。第二，所采用的污染模型（基于FBS的残留和枯草芽孢杆菌内生孢子）具有代表性但非穷尽。微生物类型、基质组成和消毒剂化学性质的变异可能影响残留去除、保留和扩散的动力学。值得注意的是，某些病原体（如病毒和支原体）可在干燥条件下存活较长时间，可能表现出比预期更强的对乙醇擦拭的抵抗力。系统综述表明医院病原体可在无生命表面持续存在数周至数月，凸显了有效清场程序的重要性。第三，PicoGreen和NanoOrange检测的检测限可能妨碍了鉴定向受影响区域极低水平的DNA或蛋白质转移。因此，无可检测转移不应被解释为完全无转移的证据。第四，回收和测量方法可能表现出表面依赖性效率；因此，观察到的材料差异可能反映真实的附着/去除现象以及提取或回收效率的变化。第五，手套转移试验在先前建立的手动擦拭条件下进行，施加力低于基于重量的表面擦拭试验且擦拭速度更高。因此，两个实验系统的绝对结果不应直接比较。相反，手套转移结果应解释为在一致手动擦拭条件下擦拭布数量对二次手套污染影响的评估。未来研究应纳入定量微生物回收方法（如拭子或冲洗回收配合CFU计数）以检测二元接触培养可能忽略的低水平重新分布、更广泛的表面类型和粗糙度指标、残留时间依赖性干燥的评估以及设计用于应对产孢微生物和生物分子残留的替代清洁剂或序贯方案。据研究人员所知，本文提出了开创性的定量评估，证明BSC内擦拭操作的双重作用——既是去污染手段也是污染扩散的潜在载体。非微生物残留（DNA和蛋白质）在擦拭过程中表现出有限的远距离转移；然而，残留即使在多次擦拭循环后仍持续存在于源位置。相比之下，活菌（枯草芽孢杆菌内生孢子）通过多次擦拭法易于重新分布至受影响区域。在更换擦拭法下，受影响区域的细菌阳性率在SUS304表面显著低于源区域，而在PET表面相应差异未达到统计学显著性。此外，研究确定了所用擦拭布数量与细菌向手套转移之间的强负相关，有效量化了通过操作人员的二次污染风险。这些发现为细胞处理设施中BSC清场的实用框架提供了基础：（1）将擦拭视为具有确定方向性（从污染到清洁）和频繁更换擦拭布的受控过程；（2）将操作人员/手套污染作为可测量终点纳入；（3）将验证标准扩展到微生物灭活之外，包括生物学相关非微生物指标的持续性。未来验证研究应纳入定量微生物回收方法以检测二元接触培养可能无法捕获的低水平重新分布。本研究推进了循证清场程序的优化，并拓宽了清洁验证标准以涵盖微生物和非微生物指标。
