《Nature Neuroscience》：Enhancer-targeted CRISPR-A rescues haploinsufficiency and mutant phenotypes in organoid models of autism
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自闭症谱系障碍（ASD）是一种高度遗传性的疾病，具有多样的临床表现。ASD遗传易感性中约15%由效应显著的从头（de novo）单倍剂量不足突变所赋予。研究人员绘制了两个高置信度自闭症基因CHD8和SCN2A的增强子图谱，并利用靶向增强子的CRISPR基因激活
自闭症谱系障碍（ASD）是一种高度遗传性的疾病，具有多样的临床表现。ASD遗传易感性中约15%由效应显著的从头（de novo）单倍剂量不足突变所赋予。研究人员绘制了两个高置信度自闭症基因CHD8和SCN2A的增强子图谱，并利用靶向增强子的CRISPR基因激活技术（eCRISPR-A）在人多能干细胞（hPSC）来源的兴奋性神经元和大脑前脑类器官中纠正单倍剂量不足的效应，利用每个基因各存在一个野生型等位基因以及内源性基因调控的优势。研究显示，eCRISPR-A在突变神经元和皮质类器官中诱导了CHD8和SCN2A表达的持续增加，挽救了基因表达水平及突变相关表型，包括基因表达和生理学表型。这些数据支持通过靶向单倍剂量不足基因的增强子实现基因激活，作为ASD和其他神经发育障碍的治疗干预手段。
自闭症谱系障碍（ASD）是一类以社交行为受损和重复行为为特征的神经发育障碍，常伴有严重功能损害，构成重大公共卫生负担。尽管ASD具有高度遗传性，但相当一部分遗传易感性——可能高达20%——由效应显著的从头突变（de novo mutations）所赋予。在Simons Simplex Collection（SSC）和Autism Genetic Resource Exchange（AGRE）等家族队列研究中，已鉴定出数百个增加自闭症风险的基因，其统计学支持水平各异。高置信度ASD（hcASD）风险基因在皮质神经发生高峰期的转录调控或突触发育通路中富集。模型系统研究提示单倍剂量不足（haploinsufficiency）是许多突变的潜在机制，这一模型得到了以下观察的支持：易感基因在人类中对杂合蛋白截短变异强烈耗竭。
在本研究中，研究人员聚焦于两个特征明确的高置信度ASD风险基因：CHD8（chromodomain helicase DNA-binding protein 8）和SCN2A（sodium channel protein type 2 subunit alpha）。CHD8与ASD强相关，似乎调控许多参与神经发育和突触功能的其他hcASD风险基因。SCN2A基因编码NaV1.2，对神经元动作电位的产生和传播至关重要，在Dravet综合征中发生突变。在皮质发育中，CHD8表达在神经发生期间达到峰值并随时间递减，而SCN2A表达较晚，在中胎儿发育期间开始。因此，通过研究这两个基因，研究人员旨在探究在发育过程中应用CRISPR-A的功效。
CRISPR-A已被有效证明在导向启动子时可上调靶基因。一个关键问题是过表达可能对细胞适应性产生有害影响，这是靶向基因启动子的常见后果。这对于单倍剂量不足基因尤其值得关注，因为此类基因以剂量敏感著称。因此，研究人员选择靶向基因增强子，其理由是在发育时间上内源性基因表达调控将更紧密地匹配，且细胞类型特异性表达将得以保留。迄今为止，据研究人员所知，尚无已发表的研究使用增强子靶向CRISPR-A靶向hcASD基因。研究结果表明，增强子靶向CRISPR-A可挽救基因表达水平和突变表型，支持使用增强子靶向基因激活作为ASD治疗方法的潜力。
研究结果方面，研究人员首先利用CRISPR编辑了胚胎干细胞系（HUES66）和诱导多能干细胞系（KOLF 2.2J）以产生杂合敲除（heterozygous knockouts）细胞系。通过建立二维兴奋性神经元培养（采用NGN2诱导，iNGN2）和三维大脑前脑类器官（hCOs）来鉴定需要挽救的异常表型。研究人员确认了CHD8突变系中编辑的存在，并如预期观察到两个CHD8突变系中mRNA和蛋白质水平约50%的降低。随后研究人员建立了皮质类器官（hCOs），CHD8 mRNA表达在突变hCOs中持续降低，蛋白质水平亦降低。CHD8的表达轨迹反映了在人类皮质发育中观察到的体内模式。CHD8单倍剂量不足在受影响个体中最具特征性的表型之一是巨脑症（macrocephaly）。研究人员测量了多个时间点的hCO大小，发现在50天和70天时，CHD8突变系产生的hCOs显著大于野生型。进一步研究发现突变系中核大小有小幅但显著的增加，并观察到突变类器官中处于S/G2/M期的细胞比例增加。在EdU鉴定的S/G2/M期细胞中，突变hCOs中EOMES+细胞比例更大，提示神经祖细胞的过度增殖也贡献于巨脑症表型。免疫荧光证实了CHD8突变hCOs中EOMES+神经祖细胞层的增宽。3个月龄hCOs的单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示CHD8+/?类器官中兴奋性神经元减少，多种祖细胞群体增加。 bulk RNA-seq显示CHD8+/? hCOs中细胞周期和祖细胞相关的Gene Ontology术语富集。这些结果共同表明hCO系统再现了患者巨脑症表型，这种增大可能部分由细胞大小增加引起，但主要归因于发育早期祖细胞的过度增殖。
关于SCN2A单倍剂量不足导致兴奋性神经元异常表型，研究人员确认了突变干细胞系中SCN2A突变，并验证了其对SCN2A mRNA和蛋白质表达水平的影响。观察到SCN2A表达在体外120天之前与野生型hCOs无显著差异，这与SCN2A在人类皮质发育中的表达一致。突变类器官中SCN2A+细胞百分比在90天至180天之间显著降低。EOMES和SATB2（分别为中间祖细胞和上层神经元标志物）在较晚时间点表达显著降低。 bulk RNA-seq显示SCN2A+/? hCOs中染色质重塑、神经干细胞和神经祖细胞相关本体术语富集，而野生型hCOs中钙信号通路、离子转运和轴丝组装富集，提示SCN2A突变hCOs比野生型更不成熟。研究人员还建立了NGN2过表达的兴奋性神经元培养，发现突变系中SCN2A表达显著降低。全细胞膜片钳电生理记录显示神经元形成了突触连接并表现出不同频率的自发突触后电流（SPC）事件，但SPC频率在细胞间高度变异，各基因型间无显著差异。尽管SCN2A突变神经元中峰值Na+电流幅度在所有系中较低，但差异未达显著性。研究人员观察到所有突变系对持续去极化电流注入的一致降低的兴奋性。此外还测量了被动膜特性和内在电生理指标，观察到系依赖性效应。这些结果表明SCN2A单倍剂量不足破坏了兴奋性神经元的发育和功能。
在增强子靶向指导RNA利用CRISPR-A增加CHD8和SCN2A表达方面，研究人员假设使用CRISPR-A增加单倍剂量不足基因的表达将有效挽救基因表达及随后的突变表型。通过结合先前发表的胎儿人脑基因组ATAC-seq和Hi-C图谱以及PsychENCODE联盟鉴定的成人脑增强子，研究人员鉴定了靶向增强子区域。主要关注胎儿脑增强子，因为它们在所检测的时间点更可能相关。鉴定了CHD8的四个推定人胎儿脑增强子和SCN2A的三个增强子，随后过滤至CHD8的两个增强子和SCN2A的一个增强子。对于CHD8，两个靶向增强子位于基因两端侧翼。研究人员首先在HEK293T细胞中筛选候选指导RNA（gRNA）的效率，使用dCas9-p300因为它是基因表达的内源性调控因子。在六个CHD8指导RNA中，只有CHD8-g1和CHD8-g5显著增加CHD8表达。两个指导RNA在原发性人神经祖细胞（phNPCs）中均显著增加CHD8表达。最后在hCOs中筛选指导RNA，两个指导RNA均增加CHD8表达超过对照感染的类器官，表明单次治疗在数月发育中具有持久性。对于SCN2A，在HEK293细胞中筛选的三个指导RNA中，SCN2A-g3产生SCN2A表达水平的显著增加，在phNPCs中也显著增加表达。在培养50天后转导hCOs，观察到感染后3个月所有测量时间点SCN2A表达增加，验证了CRISPR-A治疗的持久性。
在CRISPR-A治疗增加单倍剂量不足类器官和神经元中CHD8和SCN2A表达方面，研究人员建立了组成性表达已验证gRNA的突变系，然后在与CHD8或SCN2A稳健表达重叠的发育时间点应用CRISPR-A。作为补充方法，研究人员建立了NGN2过表达的二维兴奋性神经元培养，并在神经祖细胞阶段用CRISPR-A处理细胞。对于CHD8，在25天龄感染突变和野生型hCOs，每月收集样本持续3个月。在野生型hCOs中未观察到CHD8表达增加。在CHD8突变hCOs中观察到CHD8表达增加，尽管激活水平因系而异，只有CHD8-g1始终达到统计学显著性。在兴奋性神经元培养中，两个指导RNA在分化期间均在两个CHD8+/?系中产生CHD8表达的稳健增加。研究人员发现CRISPR-A效应的差异很大程度上归因于二维兴奋性神经元培养和三维hCO培养之间dCas9-p300表达的差异。在兴奋性神经元中观察到比hCOs更稳健的dCas9-p300表达，而GFP水平保持不变；处理hCOs中约25%的细胞表达dCas9-p300。这些结果表明CHD8表达可通过增强子靶向CRISPR-A有效增加，但高度依赖于Cas9水平。为改善dCas9-p300的表达，研究人员逆转了hCOs中载体转导的顺序，首先建立组成性表达dCas9-p300的CHD8突变系，然后在25天龄hCOs中引入gRNA，这种方法导致两个CHD8靶向指导RNA均显著增加CHD8突变hCOs中CHD8表达。由于SCN2A表达在发育后期达到峰值，研究人员在100天感染野生型和突变皮质类器官，每月收集样本长达5个月。与CHD8类似，在野生型hCOs中未观察到SCN2A表达显著增加。然而在SCN2A+/? hCOs中观察到所有测量时间点SCN2A表达显著增加。研究人员还从SCN2A突变系建立了神经元培养，观察到相同结果。这些结果表明SCN2A表达可通过增强子靶向CRISPR-A可靠增加。研究人员假设增强子靶向激活方法在某些情况下优于启动子靶向，因为靶向增强子更可能导致生理水平的基因表达，从而避免异位时空表达或剂量敏感基因过表达的担忧。确实，将CHD8和SCN2A启动子的gRNA引入hCO和神经元培养导致野生型和突变细胞中靶基因表达的显著增加。这些结果表明虽然启动子靶向和增强子靶向CRISPR-A均可靠增加靶基因表达，但对于某些剂量敏感基因，增强子靶向可能更符合生理。研究人员还考虑了在更早或更晚时间点添加CRISPR-A是否也会产生基因表达增加。在多个时间点感染野生型和突变hCOs，未发现野生型hCOs中基因表达的显著增加。对于突变系，50天和100天hCOs导致CHD8表达的适度增加趋势，而300天hCOs未显示增加。对于SCN2A，50天时CRISPR-A未导致SCN2A表达增加，与100天感染相反。这些结果支持所鉴定的增强子可能对发育时间敏感，相对匹配内源性基因表达的轨迹。
在CRISPR-A治疗挽救CHD8和SCN2A皮质类器官和神经元中的突变表型方面，用dCas9-p300感染的经治突变神经元显示EOMES表达显著降低和DCX表达显著增加至接近野生型水平。此外发现显著更多的DCX+细胞沿细胞突起存在，提示神经元成熟度增加。研究人员定量了EOMES、DCX、TUBB3和MAP2的mRNA表达，观察到经治培养中EOMES表达降低和神经元标志物表达增加，表明CHD8单倍剂量不足引起的祖细胞过多表型被增强子靶向CRISPR-A挽救。CHD8+/? hCOs在匹配时间点显著大于野生型，但CHD8g1的CRISPR-A治疗导致CHD8-1A中统计学显著的大小减小。在KOLF2.2J来源的CHD8-2A和CHD8-2B hCOs中，两个指导RNA在感染后1个月均导致统计学显著的大小减小。相比之下，用任一CHD8靶向指导RNA处理的野生型HUES66或KOLF 2.2J hCOs中未观察到显著大小变化。研究人员检测了hCO大小变化是否与CHD8表达水平变化相关，观察到线性相关。此外发现启动子靶向CRISPR-A在野生型和突变系中均显著减小hCO大小。为进一步表征CRISPR-A对CHD8突变hCOs的影响，研究人员对50天龄hCOs进行了bulk RNA-seq。比较野生型与突变型，鉴定了5,933个显著差异表达基因（DEGs）。这一模式在CRISPR-A处理的hCOs中部分逆转，无偏聚类将CRISPR-A处理的样本与野生型而非突变样本分组，表明CRISPR-A感染导致表达向野生型表达偏移。CHD8+/? + CRISPR-A hCOs中上调基因的Gene Ontology分析显示与神经元成熟相关的术语显著富集。为确定使用CRISPR-A增加SCN2A表达的功效，研究人员聚焦于先前报道的与神经元成熟和功能相关的表型。SCN2A+/? hCOs中的CRISPR-A导致EOMES和SATB2表达变化的逆转，尽管感染类器官间样本变异较大。因此研究人员测量了二维分化兴奋性神经元培养中细胞类型标志物的表达，发现治疗使EOMES和SATB2 mRNA水平更一致地增加，以及SCN2A、TUJ1、DCX和MAP2蛋白质表达增加。这些结果支持CRISPR-A治疗导致兴奋性神经元更成熟表型的结论。研究人员接下来对SCN2A+/?神经元进行全细胞膜片钳记录以评估生理挽救。能够在HUES66来源的SCN2A+/? + CRISPR-A神经元中将兴奋性恢复至野生型水平，在基强度测量、动作电位阈值和RMP方面无可检测差异，表明神经元功能和兴奋性几乎完全恢复。类似地，在患者来源的SCN2A-2和SCN2A-3 iPSC神经元中，CRISPR-A显著增加响应递增去极化电流脉冲的动作电位数量。CRISPR-A处理的患者来源神经元中诱发的动作电位数量接近野生型水平，在大多数电流脉冲中与神经典型KOLF2.2J对照无显著差异。与动作电位放电行为的恢复一致，CRISPR-A使患者来源iPSC突变神经元中的内在兴奋性参数正常化，包括基强度和动作电位阈值，而RMP在突变和CRISPR-A处理神经元中相对于野生型对照保持相似偏移。值得注意的是，患者来源iPSC神经元与HUES66来源神经元相比需要更高的电流注入以实现持续放电，表明基线内在兴奋性的系依赖性差异而非不完全功能挽救。研究人员假设这种偏移可能是患者来源SCN2A突变系中其他Na+通道亚基补偿性基因表达的结果。因此比较了所有野生型和SCN2A突变系中SCN1A、SCN3A、SCN5A和SCN8A的表达。所有亚基的表达在HUES66来源的SCN2A-1系中最低，而患者来源iPSC系SCN2A-2和SCN2A-3显示与野生型KOLF2.2J相似的亚基表达。这些发现提示患者来源iPSC神经元中替代Na+通道亚基的表达升高可能重塑兴奋性参数而不阻止CRISPR-A介导的动作电位放电的稳健挽救。综上所述，研究人员证明了CHD8和SCN2A的增强子靶向gRNA挽救了hCOs和二维神经元培养中的突变表型。
讨论部分，目前除对症治疗外，ASD可用的治疗方法很少。在本研究中，研究人员利用了核酸治疗的力量，这是治疗罕见脑部疾病的一个有前景的前沿领域。研究人员假设通过使用CRISPR-A靶向单倍剂量不足基因，将利用内源性调控机制将基因表达恢复至接近正常水平同时避免过表达，因为单倍剂量不足基因的过表达与适应性降低相关。CRISPR-A也可广泛应用于任何携带单倍剂量不足突变的个体。然而，它尚未被广泛认识为一种治疗方法。对于CHD8和SCN2A，研究人员能够使用单个增强子靶向gRNA配对dCas9-p300适度增加突变hCOs中每个基因的表达，导致突变表型的部分或完全挽救。CHD8的增加导致类器官大小接近正常化、祖细胞减少和神经元增加，并使突变中观察到的基因表达变化向正常水平恢复。SCN2A表达的增加增加了上层神经元标志物的表达并挽救了兴奋性神经元培养中的神经元放电输出，并具有系依赖性的内在兴奋性参数正常化。研究人员复制了先前的研究结果，展示了CHD8单倍剂量不足中的过度增殖表型和SCN2A单倍剂量不足中的电生理异常，这两种ASD的单基因病因具有极高的ASD外显率。本研究使用的两个HUES66来源的CHD8+/?干细胞系仅相差CHD8-1B相对于CHD8-1A的一个额外4-bp缺失。尽管两者均显示CHD8表达降低，研究人员观察到hCO组成和CRISPR-A反应的差异。然而这些差异均未达到统计学显著性，且CHD8-1A和CHD8-1B类器官之间无显著DEGs。在KOLF2.2J来源的系中复制研究发现表明这些结果不限于HUES66背景。总体而言，结果表明CHD8突变系中神经发生的挽救，这已在其他研究中被强调为关键突变表型。在SCN2A缺陷hCOs中，研究人员观察到在SCN2A表达预期达到峰值的发育后期，上层神经元相对于野生型减少，这与显示前额叶皮质切片中兴奋性受损的动物模型一致。在SCN2A缺陷hCO和iNGN2神经元以及SCN2A+/?患者来源iPSC系中，研究人员能够挽救基因表达并随后观察到兴奋性神经元中信号活动的挽救。尽管研究人员担心使用启动子靶向gRNA构建体时出现过表达，但其他课题组的工作已靶向启动子区域而未对细胞适应性产生明显影响。这可能归因于多种因素，包括可能限制基因过表达的内源性调控机制、培养系统或基于正常基因功能的不同耐受性。研究人员注意到在CHD8实验中，靶向不同增强子的gRNA构建体表现出不同水平的CHD8激活。此外，CHD8和SCN2A的启动子靶向gRNA导致野生型和突变培养中靶基因表达的稳健增加。鉴于增强子靶向构建体在野生型系中未导致任何激活，这些观察提示增强子靶向CRISPR-A可能允许使用更强大的激活构建体而无过表达风险。此外，研究人员展示了增强子靶向的一定程度的时间特异性，据其所知，这先前未在启动子靶向构建体中展示。研究人员将这些结果视为重要的原理验证，并认识到未来工作应解决的局限性。第一，hCOs中gRNA和dCas9-p300的联合表达受限于dCas9-p300慢病毒仅能感染hCOs中一部分细胞的能力，表明进一步优化病毒感染、构建体和替代Cas酶的使用将增加该方法的临床实用性。第二，eCRISPR-A的效应随时间递减。从平行内源性发育表达的角度来看，这可能是最佳的，尽管它提示挽救成人表达可能需要靶向不同的增强子或启动子。第三，多个gRNA在靶向同一目标基因时可能表现出协同效应；未来优化可能包括组合指导RNA以增加基因表达。研究人员还基于CRISPR编辑的见解对预测gRNA效率进行了事后分析，但未能鉴定出更可能预测gRNA功效的增强子特征。突变表型被部分挽救这一点指向了随着效率提高增加表型挽救的潜力。eCRISPR-A成功临床应用的注意事项包括脱靶效应的可能性。为控制这一点，研究人员测量了CHD8和SCN2A邻近和密切关联基因的表达，未发现表达水平增加。其次，存在在相关发育时期增加表达的潜在担忧。为解决这一点，研究人员聚焦于预测在胎儿脑发育期间特异性活跃的增强子。在预期表达峰值之后引入CRISPR-A的效果仍是一个开放问题。这可能因基因而异；由于CHD8是许多下游过程（包括许多其他hcASD基因）的关键调控因子，后期CRISPR-A治疗可能获益有限。相比之下，SCN2A可能可以在较晚阶段靶向。最后，对于如CHD8这样观察到中枢神经系统外表现的基因，可能需要不同的增强子指导RNA以靶向所有受累器官系统。总之，本研究展示了iPSC来源细胞在神经发育障碍建模和临床前测试中的实际应用。研究人员提供了一个可适用于靶向其他hcASD基因的工作流程，以及使用基因激活技术作为神经发育障碍治疗干预的原理验证。
研究结论部分翻译：总之，本研究证明了iPSC来源细胞在神经发育障碍建模和临床前测试中的实际应用。研究人员提供了一个可适用于靶向其他高置信度自闭症谱系障碍基因的工作流程，以及使用基因激活技术作为神经发育障碍治疗干预的原理验证。
