《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Development of a targeted differential mobility spectrometry UHPLC-MS/MS quantitation method for free long-chain and hydroxylated fatty acids
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尽管长链脂肪酸在动物和人体代谢中的作用已得到充分确立，但其羟基化代谢物在癌变过程中的参与情况仍不明确，主要原因是缺乏稳健的定量分析方法。本研究提出了一种新型分析方法，能够对小鼠结直肠肿瘤组织和非肿瘤组织中长链脂肪酸及其羟基化代谢物的顺式和反式异构体进行定量。采
尽管长链脂肪酸在动物和人体代谢中的作用已得到充分确立，但其羟基化代谢物在癌变过程中的参与情况仍不明确，主要原因是缺乏稳健的定量分析方法。本研究提出了一种新型分析方法，能够对小鼠结直肠肿瘤组织和非肿瘤组织中长链脂肪酸及其羟基化代谢物的顺式和反式异构体进行定量。采用液相色谱、差异迁移谱（DMS）和串联质谱（LC-DMS-MS/MS）相结合的技术，研究人员实现了多种游离脂肪酸的分离和定量，包括九种饱和脂肪酸、十一种单不饱和脂肪酸、六种多不饱和脂肪酸、四种羧化脂肪酸和九种羟基化脂肪酸，涵盖了不同的饱和度和异构体形式。该方法使用非羟基化脂肪酸的氘代和13C标记同位素内标进行了验证。研究人员对小鼠结直肠肿瘤组织和非肿瘤组织的比较分析揭示了各分析物谱的显著变化，尤其是长链多不饱和脂肪酸C20:4及其羟基化代谢物C20:4-5-OH和C20:4-12-OH。这些浓度上的特征性差异将为特定长链羟基化脂肪酸在结直肠肿瘤发病机制中的潜在参与提供新的见解。
研究背景方面，脂肪酸是细胞膜的重要组成成分，在细胞信号传导、能量储存和代谢调控中发挥关键作用。随着脂质组学研究的深入，羟基化脂肪酸作为脂质组的重要组成部分日益受到关注。然而，样品制备和分析方面的挑战阻碍了全面、灵敏且稳健的脂肪酸靶向定量方法的发展。气相色谱（GC）虽已被确立为长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFAs）定量分析的可靠方法，但其样品制备需要多步操作如溶剂萃取和酯化衍生化，限制了同分异构体天然构型的鉴定。近年来高分辨率液相色谱-质谱（LC-MS）方法的发展为无需衍生化的脂肪酸直接分析提供了机会。离子迁移谱（IMS）技术的引入提供了基于气相离子迁移率的正交分离维度，而差异迁移谱（DMS）作为靶向脂质组学中同分异构体分析的替代方案，利用平行平面金属板和精确控制的温度、电压及气体流量实现离子分离。然而，对于羟基化脂肪酸，仍存在异构体分离困难、分析物浓度低、生物样品基质效应强、电离效率差以及参考标准品稀缺等重大挑战。近年来研究强调脂质尤其脂肪酸在肿瘤发生、发展和转移中的关键作用，癌细胞中脂质加工常发生紊乱导致脂质组成和分布改变。在此背景下，研究人员旨在开发一种选择性定量方法，利用LC-DMS-MS/MS对生物组织中中长链脂肪酸及其羟基化代谢物进行分析，并比较氘代与13C标记内标的验证性能，最终应用于小鼠结直肠癌模型以评估肠道组织表型间的潜在差异。
在关键技术方法方面，研究人员采用液相色谱-差异迁移谱-串联质谱（LC-DMS-MS/MS）联用技术，在配备SelexION+ DMS池的三重四极杆/线性离子阱质谱仪上进行数据采集，使用Kinetex C18色谱柱（100×2.1 mm，1.7 μm）进行色谱分离，以含5 mM乙酸铵缓冲液的水相和乙腈/异丙醇/水有机相进行梯度洗脱。DMS优化参数包括化学修饰剂（2-丙醇）、分离电压（SV=4000 V）、补偿电压（CoV）等。采用定量核磁共振（qHNMR）光谱法确定标准品储备液的准确浓度和纯度。方法验证使用氘代和13C标记同位素内标，在无分析物猪肠组织基质中进行准确度、精密度、检测限（LoD）和定量限（LoQ）评估。研究样本来源于已发表的结肠癌小鼠模型，共12只小鼠（nM-NT=6；nM-T=6），最终纳入24个样本（nNT=8；nT=16），所有肿瘤样本均在动物12周龄同一肿瘤阶段采集。统计分析使用R软件（版本4.4.1）进行，包括OPLS-DA模型构建。
研究结果方面，在方法开发部分，采用非极性C18固定相的色谱分离实现了九种中长链饱和脂肪酸、大多数顺反共轭不饱和脂肪酸、九种羟基化脂肪酸和四种二羧酸的分离。然而，同分异构化合物如单不饱和脂肪酸（C18:1-9(Z)、C18:1-9(E)、C18:1-11(Z)、C18:1-11(E)）及某些结构或双键位置不同的羟基化羧酸仅依靠固定相和乙酸铵缓冲流动相的相互作用无法分离。研究人员通过在DMS中应用不连续补偿电压（CoV）实现了同分异构分析物的进一步分离，各分析物的CoV值在?30至0 V范围内确定。在1500–4000 V范围内优化连续分离电压，确定4000 V为最佳条件，尤其对于分离具有挑战性的单不饱和C18脂肪酸异构体。比较三种溶剂（甲醇、2-丙醇、乙腈）作为化学修饰剂的效果，2-丙醇提供了优于乙腈或甲醇的分离效果。增加修饰剂流速或池温度未改善分离，因此选择最温和的操作条件。使用优化参数后，所包含的顺/反共轭脂肪酸实现了清晰分离。
在方法验证部分，由于缺乏与肠道组织类似的无分析物基质，中长链及羟基化脂肪酸的验证具有挑战性。羟基化脂肪酸的定量使用氘代标准品（C20:4-20-OH-d6）进行，其他分析物通过比较氘代和13C标记的工作流程完成验证。检测限（LoD）和定量限（LoQ）在无基质溶剂甲醇中测定，猪肠道基质和溶剂基工作流程的绝对浓度可比，偏差小于20%。氘代标准品的LoD值大多低于1 ng/mL，范围为0.02 ng/mL（C14:0-1,14-COOH）至0.87 ng/mL（C18:2）；13C标记工作流程为0.03 ng/mL至0.71 ng/mL。羟基化脂肪酸的LoD值为0.29–233.39 pg/mL和0.96–777.97 pg/mL，决定系数（R2）为0.981–0.997，确认了线性关系。准确度研究中，所有氘代分析物的准确度范围为81.19%至118.06%，与13C标记验证范围（85.56%至114.45%）密切匹配。羟基化脂肪酸的回收率范围为85.15%至113.61%。精密度评估中，日内和日间测量的变异系数（CV）均不超过15%，表明方法具有高精密度。总之，差异迁移谱实现了不同构象脂肪酸的明确定性和定量分析，显著降低了基质效应并提高了灵敏度，氘代和13C标记验证均适用于中长链脂肪酸的定量，羟基化脂肪酸可使用氘代标准品可靠定量。
在 validated method 应用于结直肠癌小鼠模型部分，定性分析显示所有样本中两种表型均含有39种所检测的脂肪酸，与结构类别无关，凸显了全面定量评估的必要性。定量比较和得分图分析揭示了荷瘤小鼠肠道组织与对照组之间脂肪酸浓度的显著差异和独特的脂质谱。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）提示了区分性分析物，致病组织中若干脂肪酸在右上象限显示出最大的定量差异，而C18:1-12(Z)-9,10-OH在未受影响组织中更为突出。尽管存在立体异构多样性，顺式和反式异构体在肿瘤组织浓度中未显示差异。相反，健康组织中反式脂肪酸含量显著低于肿瘤组织，顺式异构体浓度在健康组织中也有所降低。对于中链饱和脂肪酸，非肿瘤组织中的浓度范围较肿瘤组织更窄，而大多数长链不饱和脂肪酸在肿瘤组织中含量较低。不饱和脂肪酸包括羟基化物种在非肿瘤组织中呈现更广泛的分布。某些长链不饱和脂肪酸（C16:1、C20:4、C22:5、C22:6）以及短链（C6:0-2-OH(iso)）和长链羟基化脂肪酸（C20:4-5-OH）在健康无肿瘤组织中浓度显著较低。
讨论部分总结如下：差异迁移谱（DMS）的应用显著改善了同分异构和异构化合物的分离，同时大幅降低了背景噪声，尤其对于羟基化脂肪酸因其独特的理化性质。同位素标记标准品的使用在验证过程中未引入显著差异，但合适标准品的可获得性仍是限制因素。本研究证明了中长链及羟基化脂肪酸的微量定量方法，并验证了该方法在生物组织中的适用性。此外，所开发的方法能够检测小鼠肠道组织中的分子特征，促进评估特定组织类型中的立体化学和链长效应。值得注意的是，该方法基于分子谱可靠地区分了受病原影响的肿瘤组织与健康非肿瘤组织。然而，仍需进一步研究以阐明这些差异背后的生物学机制，各分析物组对组织特征的影响仅能部分解析，值得额外研究。
研究结论部分翻译如下：总之，差异迁移谱（DMS）的应用显著改善了同分异构和异构化合物的分离，同时大幅降低了背景噪声，尤其对于羟基化脂肪酸因其独特的理化性质。同位素标记标准品的使用在验证过程中未引入任何显著差异；然而，合适标准品的可获得性仍是限制因素。本研究证明了中长链及羟基化脂肪酸的微量定量方法，并验证了该方法在生物组织中的适用性。此外，所开发的方法能够检测小鼠肠道组织中的分子特征，促进评估特定组织类型中的立体化学和链长效应。值得注意的是，该方法基于分子谱可靠地区分了受病原影响的肿瘤组织与健康非肿瘤组织。尽管如此，仍需进一步研究以阐明这些差异背后的生物学机制，各分析物组对组织特征的影响仅能部分解析，值得额外研究。
