《Microsystems & Nanoengineering》：Multiplexed node-pore sensing for high-throughput, label-free single-cell detection
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本研究提出了一种多路复用四通道节点-孔道传感（Node-Pore Sensing, NPS）平台，其中每个通道均编码有通过组合优化筛选出的、具有最小非周期互相关的独特曼彻斯特（Manchester）编码序列。基于各Gold码序列节点-孔道结构的结构分类器在14
本研究提出了一种多路复用四通道节点-孔道传感（Node-Pore Sensing, NPS）平台，其中每个通道均编码有通过组合优化筛选出的、具有最小非周期互相关的独特曼彻斯特（Manchester）编码序列。基于各Gold码序列节点-孔道结构的结构分类器在1480个带标记的实验过孔事件上实现了99.3%的单通道识别准确率，且无需模板对齐或速度校正。线性支持向量机（Support Vector Machine, SVM）成功将单通道事件与多通道重合事件区分开来，从而实现了跨全部四个通道的无标记、高通量单细胞检测。该多路复用架构为在并行通道上测量细胞力学特性（如刚度和恢复时间）提供了途径，将原代人乳腺上皮细胞（human mammary epithelial cells, HMECs）的NPS力学表型分析推向临床研究所需的高通量水平。
节点-孔道传感（Node-Pore Sensing, NPS）是一种微流控电阻脉冲技术，通过测量细胞穿过由宽（节点）和窄（孔）交替段组成的微流控通道时产生的电流脉冲，量化单细胞的生物物理特性，包括尺寸、表面标志物和可变形性。NPS已成功用于无标记免疫表型分析急性髓系白血病原始细胞，以及对人类乳腺上皮细胞（HMECs）进行力学表型分析以评估乳腺癌易感性。然而，NPS的通量从根本上受限于重合事件：多个细胞同时穿过通道会产生叠加的电流信号，简单阈值法难以将其分解，导致这些事件被丢弃。使用单对电极并行测量多个通道可按比例提高通量，但需要识别每个事件的来源通道。此前，Kellman等人已证明曼彻斯特-巴克（Manchester-Barker）编码可通过匹配滤波检测和逐次干扰消除实现通道内重合校正。在此基础上，本研究将NPS平台推进至包含四个并行通道，每个通道编码独特的曼彻斯特序列，从而稳健地识别每个细胞的过孔事件与其测量信号的对应关系。如Fig. 1a所示，单入口通过被动混合器将流体等分为四路进入并行编码通道，每个通道在传感区域前经过滤以防止堵塞。所有四个通道共享一对电极，因此每个过孔细胞产生的电流脉冲波形可唯一标识其来源通道（Fig. 1b）。完整四通道器件的照片如Fig. 1c所示。
在通道编码设计方面，标准准正交码族（如Gold码）假设周期性互相关，这在细胞于任意时刻过孔时不成立。因此，研究人员采用组合优化方法筛选一组四个长度为7的二进制序列——经曼彻斯特编码后产生本研究中使用的14位通道签名。枚举了全部2?=128个长度为7的二进制序列，通过曼彻斯特编码转换为单极性码，并计算所有码对的最大零均值非周期互相关。通过迭代修剪旁瓣最大的码对，直至剩余4×4最优子矩阵，从而选出一组四个码。曼彻斯特编码还保证所有通道的基线电阻相等，因为每个码包含相同数量的节点和孔（孔：180 μm×20 μm；节点：60 μm×60 μm）。所得四个序列列于Fig. 1d。
在器件制造方面，采用软光刻技术制造微流控通道，以SU-8 3025光刻胶（Kayaku, Westborough, MA, USA）图案化至20 μm特征高度。通道以PDMS（Sylgard 184, 10:1比例；Dow, Midland, MI, USA）浇铸，80 °C固化，氧等离子体键合至预制造Ti/Pt/Au电极（100/250/250 ?）的玻璃基底。
在信号采集与实验数据方面，为表征器件性能，使用聚苯乙烯微球（直径16.1±1.9 μm，Spherotech, Lake Forest, IL, USA）作为校准标准品。以3 kPa压力驱动浓度为4.3×10?颗粒/mL的微球通过完整器件。测量电流经定制电流放大器电路与电流前置放大器（1211, DL Instruments, Bay City, MI, USA）串联放大，由数据采集板（PCI-6251, National Instruments, Austin, TX, USA）以50 kHz采样，使用定制MATLAB软件（MathWorks, Natick, MA, USA）采集。
在单通道识别结果方面，Fig. 1e展示了四个通道各自的单通道过孔事件，说明每个曼彻斯特码序列编码的独特电流信号模式，Fig. 1f展示了每种可能重叠信号类型的重合事件。Fig. 2a、b展示了全部五类事件的最大电流降幅和持续时间分布。单通道事件在幅度和持续时间上均与所有多通道类别清晰分离（p<0.0001，Mann-Whitney U检验），反映了重合电阻信号的叠加性质。在重合类别中，2通道事件与3通道事件存在差异（p<0.0001），而2通道与同通道事件、3通道与4通道事件之间不可区分（ns）。然而这些分布存在大量重叠，因此仅凭标量幅度和时间无法识别产生单个事件的具体通道组合。Fig. 2c、d展示了实验数据上单通道识别和重叠通道数估计的混淆矩阵。单通道识别直接利用每个Gold码序列编码的节点和孔信号结构：Ch1恰好产生4个电阻峰（节点优先码），而Ch2–4各产生6个峰，具有通道特异的双孔定位，无需模板对齐或速度校正。研究人员分析了1485个带标记的单通道过孔事件，对其中1480个应用通道识别；四个事件因通道注释模糊被排除，一个因孔峰结构无法可靠提取被排除。结构分类器对Ch1–Ch4的准确率分别为99.6%、99.4%、99.0%和99.1%，总体准确率为99.3%。重叠通道数估计使用线性支持向量机（SVM），基于五个标量特征（最大电流降幅、通道过孔时间、电流-时间比、电流降幅偏度和相对单通道中位数的电流降幅比）进行训练。SVM对单通道事件的准确率为98.7%，2通道重合事件为88.7%，3通道为58.3%，4通道事件为20.0%。准确率随通道数增加而降低，与Fig. 2c、d中观察到的特征重叠一致，即2、3、4通道事件仅凭标量波形特征越来越难以区分。
在讨论与结论方面，本研究展示了一种多路复用四通道NPS平台，其曼彻斯特编码序列经优化具有最小非周期互相关。基于Gold码节点-孔道结构的结构分类器在实验数据上实现了99.3%的单通道识别准确率，线性SVM对单通道事件的重合通道数估计准确率高达98.7%，对四通道同时事件降至20.0%。这些结果建立了一种使用NPS的高通量、无标记、多路复用单细胞检测策略。未来工作将利用该高通量平台测量原代HMECs的细胞力学特性，推动单细胞力学表型分析迈向乳腺癌风险评估所需的人群规模。
