《Cell Genomics》：RNA sequencing reveals molecular subtypes across adenocarcinoma, squamous, and small cell lung cancer
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本研究整合了来自主要肺癌类型的1,824例肿瘤的RNA测序（RNA-seq）数据，以考察肿瘤基因表达模式与组织学诊断之间的关系。由此构建的参考图谱识别出九个转录簇，包括一个神经内分泌样腺癌组以及组织学混合的区域。这些转录簇还显示出与临床特征、遗传改变、免疫特征
本研究整合了来自主要肺癌类型的1,824例肿瘤的RNA测序（RNA-seq）数据，以考察肿瘤基因表达模式与组织学诊断之间的关系。由此构建的参考图谱识别出九个转录簇，包括一个神经内分泌样腺癌组以及组织学混合的区域。这些转录簇还显示出与临床特征、遗传改变、免疫特征及生存期的关联。一个交互式Oncoscape资源使研究人员能够探索整合数据，并将患者肿瘤与患者来源异种移植（PDX）模型进行比较。
研究背景：肺癌在临床上主要按组织病理学分为非小细胞肺癌（NSCLC）与小细胞肺癌（SCLC），其中NSCLC约占全部肺癌的85%，最常见亚型为肺腺癌（LUAD）与肺鳞状细胞癌（LUSC）。LUAD是最常见的组织学亚型，具有显著的分子与临床异质性，除EGFR或KRAS驱动等已充分表征的亚群外，相当比例肿瘤缺乏清晰的分子分层，给预后判断与治疗决策带来困难。SCLC以快速增殖、神经内分泌特征及TP53、RB1近乎普遍失活为特点，而新出现的证据表明诊断边界之间在分子水平上并非严格可分，SCLC与腺癌之间存在转录重叠与表型可塑性。鳞状细胞癌（SCC）通常与显著吸烟暴露相关，以TP53改变、SOX2扩增及鳞状分化程序失调为特征，其内部亦存在免疫相关与代谢亚型等未解结构。基于bulk RNA-seq的统一分子图谱可提供无偏框架以解析此类异质性，通过整合大量已发表数据集实现数据低成本复用、以更大样本量提升统计效力，并捕捉常被离散分类掩盖的连续生物学变异；单细胞技术虽分辨率高，但队列规模与实验成本限制了其刻画群体水平结构的能力。本研究延续研究团队此前针对脑肿瘤（髓母细胞瘤、室管膜瘤、脑膜瘤）构建参考分子图谱的范式，将其拓展至组织学多样性与临床负担均突出的肺癌。
研究内容与结论：研究人员从多个公共来源收集并统一处理原始测序数据，构建了包含腺癌（n = 966）、SCC（n = 628）、SCLC（n = 150）及未分类NSCLC（n = 80）共1,824例样本的大规模转录组队列，经严格质控与批次校正后，采用共识聚类构建整合参考图谱，并以成对受控流形近似（PaCMAP）进行可视化，实现跨组织学边界的联合展示与分析；系统叠加临床、人口学与分子注释，定义具有共享生物学程序的稳健疾病区域。该图谱通过Oncoscape提供交互式框架，用于生物标志物发现、谱系状态解读、免疫状态注释及候选治疗假设生成。其重要意义在于表明组织学类别与保守的肿瘤内在轴及免疫轴相交织，将上述状态组织于单一参考框架内，为生物学解读、模型评估与假设生成提供资源。
关键技术方法（不超过250字）：研究为回顾性二次分析，样本来自17项独立研究的公开bulk RNA-seq数据，包括TCGA-LUAD（n = 529）、TCGA-LUSC（n = 510）、CPTAC-3（n = 266）、APOLLO-LUAD（n = 87）及Bakr等的124例NSCLC（SRP117020）等；外部投影数据来自GSE130160与E-MTAB-11230。原始FASTQ经FastQC与MultiQC质控，STAR比对至GENCODE GRCh38，HTSeq定量，ComBat-seq校正批次，DESeq2行方差稳定变换（VST）；共识聚类采用ConsensusClusterPlus，降维采用PCA、t-SNE、UMAP与PaCMAP；差异表达用DESeq2，通路分析用EnrichR与基因集变异分析（GSVA）；融合检测用Arriba与STAR-Fusion，拷贝数用CaSpER推断；肿瘤纯度与免疫浸润用PUREE、ESTIMATE、xCell与CIBERSORTx评估；生存分析用Kaplan–Meier与多变量Cox模型。
研究结果：
统一肺癌转录组图谱的构建：对1,824例肿瘤、19,055个蛋白编码基因行共识聚类，未如预期直接分出三大组织学区室，而是得到以腺癌为主、鳞癌富集及第二个腺癌相关区室（含相当比例SCLC与NSCLC-NOS）三大转录区室；对异质的腺癌-小细胞混合区室二次聚类得到A2、A3、A4、SC与MD1五组，鳞癌富集区室聚类得到SQ1与SQ2，最终注释为九簇。比较PCA、UMAP、t-SNE与PaCMAP显示主要疾病与簇级关系在各方法中均可重现，PaCMAP因局部邻域与跨组织学关系展示最清晰而作为主要可视化框架。识别出两个混合诊断区域：MD1邻近SC，由腺癌22.97%、NSCLC/NOS 8.18%、SCLC 21.62%与SCC 47.29%构成；MD2位于A1内，由腺癌58.74%、NSCLC/NOS 6.29%、SCLC 18.81%与SCC 16.08%构成。以25%、50%、70%、90%子样本重建嵌入显示主要拓扑在50%以上得以保留。多变量Cox模型（校正队列、性别、吸烟状态）显示相对A1，A4与SC与更差总生存相关（A4：HR 2.63，95% CI 1.48–4.68，p < 0.001；SC：HR 1.86，95% CI 1.14–3.05，p = 0.014），整体模型显著（全局log rank p = 0.003），一致性指数0.62；Tukey校正两两比较显示预后信号主要集中于涉及A4与SC的比较；MD1内组织学分层生存无显著差异，MD2内SCLC病例生存差于LUAD与LUSC。
经典谱系标志物与基因组特征与图谱组织一致：NKX2-1在腺癌与SCLC优势区域富集、在SCC簇降低，KRT5等角蛋白在鳞癌区域富集，NEUROD1标记SCLC区域。RNA-seq推断的拷贝数改变反映已知组织学模式：SCC见3q（24.95%）、5p（15.5%）、8q（15.07%）重复获得及3p（11.83%）、8p（11.5%）缺失，腺癌见5p（17.84%）、8q（18.35%）、7p（17.09%）获得。
转录簇的临床、分子与肿瘤微环境注释：融合事件呈簇特异性定位，ALK（1.7%）、ROS1（2.3%）、RET（0.8%）、MET（0.8%）及NTRK2重排被检出，ROS1与ALK富集于A1，NRG1融合于SQ1，NTRK2融合于SQ2。1,305例（71.5%）有配对DNA突变数据，EGFR突变富集于A1并在鳞癌相关簇缺失，KRAS突变富集于腺癌相关区域而在SQ1、SQ2缺失，BRAF与MET突变亦呈显著簇关联；非同义突变负荷在A3、A4、MD1、SQ1、SQ2较高，在A1、A2、MD2较低。组织学与簇归属强相关（全局Fisher精确检验，FDR = 3.70 × 10?4）：A1–A4富集LUAD，A2全为LUAD，A1中594/658（90.3%）为LUAD；SQ1与SQ2分别有323/358（90.2%）与201/215（93.5%）为LUSC/SCC；SC中98/103（95.1%）为SCLC。A1富集I期、SC富集III期、A4富集IV期；A1富集女性与非吸烟者，SQ1、SQ2、SC富集男性，SQ1与SQ2富集现吸烟者。SQ1见较高推断CD8 T细胞与M1巨噬细胞比例，MD2见较高单核细胞与CD8 T细胞比例，A4多种方法下免疫与微环境评分较低；SQ1的CD274表达与xCell免疫评分较低而PUREE纯度亦较低；神经内分泌标志物评分在SC最高、A3亦富集，支持其神经内分泌样腺癌表型。
与既有肺癌分子亚型的关系：将九簇与LUAD、LUSC、SCLC表达亚型比较，LUAD推断的bronchoid/TRU、magnoid/近端增殖型与squamoid/近端炎症型与已发表注释大体一致；A1含bronchoid（43.2%）、squamoid（28.4%）与magnoid（11.9%），A2、A3、A4富集magnoid程序（分别53.6%、81.6%、74.6%）。LUSC中SQ2以classical程序为主（83.3%），SQ1较异质（basal 44.4%、secretory 23.7%、classical 6.7%、primitive 6.2%，9.2%不确定）；primitive程序在MD1富集（40.5%），secretory亚型在MD2富集（16.1%）。SCLC亚型分布于多个区域：SC含SCLC-N（29.1%）、SCLC-A（23.3%）、SCLC-I（15.5%）、SCLC-P（1.9%）及25.2%不确定；SCLC-P在MD1富集（13.5%），SCLC-I在MD2富集（14.0%）。簇与既有亚型标签显著相关（Monte Carlo卡方检验，均p < 0.001），Cramer's V为0.516与0.593（LUAD预测与报告）、0.692与0.622（LUSC）、0.539（SCLC预测），但调整兰德指数与归一化互信息仅显示部分一致，表明各簇恢复了既有亚型相关生物学程序但不可还原为现有离散分类。
腺癌相关与混合诊断区域呈不同转录程序：差异表达显示A2–A4、MD1、MD2相对A1具有互不重叠的生物学程序。A2富集脂质与脂肪酸代谢通路（含FASN上调）及以NQO1、NFE2L2为标志的NRF2轴氧化应激程序。A3为具显著神经内分泌程序的腺癌，上调ASCL1、NEUROD1、INSM1、CHGA、CHGB、DLL3、MYCN、MYCL、RET、SYP与NCAM1，而YAP1与POU2F3未富集、NKX2-1无显著改变，提示其不对应SCLC-Y或SCLC-P状态，被定义为神经内分泌样腺癌状态。A4富集外源物质代谢，多种细胞色素P450酶（CYP24A1、CYP2C18、CYP2C19、CYP2C9、CYP4F11、CYP4F2、CYP4F3）显著上调，伴谷胱甘肽合成与氧化还原防御基因（GCLC、GSR、GSTP1）及铁死亡相关调节因子SLC7A11激活，戊糖磷酸途径酶G6PD与PGD上调提示NADPH生成与抗氧化缓冲增强，被定义为氧化还原适应的腺癌状态。MD1表现为细胞周期调节因子CDK1、CDK2、E2F1表达升高，DNA复制机器MCM2–7与PCNA及有丝分裂检查点调节因子BUB1、AURKA、PLK1富集，被定义为增殖性混合诊断区域。
免疫浸润型腺癌状态呈协同的适应性免疫与固有免疫激活：A1与MD2富集适应性免疫标志物CD3D、CD3E、CD4、CD8A、CD8B、LCK与ZAP70，免疫检查点分子PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）、CTLA4、LAG3、TIGIT显著上调；干扰素信号通路诱导，STAT1、CXCL9、CXCL10、GBP1升高；髓系与中性粒细胞相关基因MPO、S100A8、CXCR2富集；细胞外基质与基质重塑基因COL1A1、COL3A1、MMP9、FN1上调。A1与MD2的PUREE估计肿瘤纯度较低，基于CD4、SASH3、CD53、PLEK、EVI2B的GSVA评分升高，支持其免疫富集转录谱反映免疫/淋巴成分混入而非纯肿瘤内在表达差异。
SCLC分化为增殖性与YAP1相关免疫状态：SCLC样本定位于两个空间域，即SCLC优势簇SC与嵌入免疫富集腺癌域（MD2/A1）的混合诊断区域。SC保留ASCL1、NEUROD1、INSM1等经典神经内分泌调节因子富集；MD2内SCLC显著上调YAP1、VIM与WWTR1，与SCLC-Y亚型一致，并富集细胞因子信号与炎症反应等免疫相关通路，与A1免疫浸润状态特征相呼应，其18基因T细胞炎症特征评分升高。SC相对MD2内SCLC富集细胞周期、有丝分裂纺锤体组装、姐妹染色单体黏连与G2/M检查点调控等增殖与有丝分裂通路（含细胞周期、有丝分裂、有丝分裂前中期、polo样激酶介导事件、复制应激下ATR激活、G1/S转录调控等Reactome通路），SC邻近复制驱动的腺癌簇A4与MD1，支持跨组织学边界共享增殖转录程序。据此，SCLC诊断肿瘤至少分为高度增殖、复制应激相关的SC与免疫相关混合诊断区域MD2两种生物学不同状态。
鳞状细胞癌分化为氧化还原适应与免疫浸润状态：SQ1显示适应性免疫通路激活，CD3D、CD3E、CXCL9、CXCL10、PDCD1升高，并富集细胞因子-受体相互作用、JAK-STAT信号及血管重塑与组蛋白瓜氨酸化相关过程，为免疫炎症型鳞癌状态。SQ2选择性上调NTRK2（TrkB）（logFC = 1.40，padj = 2.3 × 10?6）及其配体BDNF（logFC = 1.15，padj = 2.1 × 10?4），该富集为NTRK2特异，NTRK1与NTRK3优先表达于SQ1，SQ2亦富集NTRK2基因融合；SQ2伴SLC7A11与GCLC表达升高及钙转运、醌类代谢（叶绿醌与甲萘醌）、白三烯代谢、线粒体核糖体组装与RNA修饰通路富集，同时维持SOX2与TP63等经典鳞状谱系标志物，提示代谢适应下谱系稳定。据此鳞癌分为免疫浸润状态与代谢适应、氧化还原缓冲的肿瘤内在状态。
基因表达谱提示区域特异性候选治疗假设：KIT与RET富集于神经内分泌相关状态的离散区域（含A3腺癌簇与部分SCLC），DLL3富集于图谱神经内分泌优势区域，NTRK2集中于代谢适应的鳞癌状态SQ2，MET在特定腺癌域升高，ROS1定位于腺癌图谱内受限区域；上述模式并非均匀分布于组织学类别，而与转录定义区域一致，为区域特异性治疗假设提供框架，但基于bulk RNA表达，不确立功能依赖或药物敏感性，需扰动筛选、药理学实验、类器官或PDX模型、免疫共培养及具治疗注释的临床队列验证。
患者来源异种移植模型投影至参考图谱：将两项已发表研究的独立PDX转录组（43例小细胞、4例鳞癌、2例腺癌）以两条独立流程投影至参考嵌入，各组织学PDX均定位至相应肿瘤优势区域；在可得配对初始手术切除肿瘤（SRT，n = 6）与相应PDX的腺癌与鳞癌中，直接比较显示空间邻近，部分SRT-PDX对坐标近乎重叠，支持移植过程中肿瘤内在转录程序的保留，并强化图谱作为模型验证定量框架的效用。
讨论部分总结：肺癌按组织病理学分为腺癌、SCC与SCLC虽指导临床管理，但不能完整捕捉类别内与类别间的分子异质性；整合1,824例肿瘤的统一转录组图谱表明bulk RNA-seq谱可组织为补充传统组织病理分类的结构化转录状态连续谱。其贡献有三：概念上提供跨组织学共享框架，使既有LUAD、LUSC、SCLC亚型程序可在同一参考空间比较；方法上统一处理多独立队列bulk RNA-seq数据，从全基因组蛋白编码基因表达而非仅预定义亚型特征推导转录结构；操作上以交互式参考资源部署，使用户可在共同肺癌图谱中考察肿瘤、簇、分子注释、拷贝数改变、融合、免疫特征与候选程序。图谱应视为在更广参考框架内组织而非替代既有组织学或分子亚型系统。临床与分子注释显示病理学家判定组织学是转录位置最强相关因素，MD1与MD2捕捉混合诊断转录邻域，神经内分泌标志物与肿瘤微环境特征亦呈强区域结构；性别、吸烟状态、分期、突变负荷与个别致癌改变呈簇特异性富集但不完全解释整体组织。跨组织学肿瘤沿反复出现的肿瘤内在程序与免疫相关状态组织：腺癌解析为代谢重编程、神经内分泌样、外源物质/氧化还原适应、增殖与免疫富集亚型，表达ASCL1、NEUROD1与DLL3的腺癌簇提示跨诊断边界的神经内分泌相关转录趋同；SCLC分为增殖性神经内分泌状态SC与YAP1相关免疫状态MD2，鳞癌分为氧化还原适应、TrkB富集的肿瘤内在状态SQ2与免疫浸润状态SQ1；免疫富集区域共享T细胞、干扰素信号与检查点程序上调及肿瘤纯度降低，肿瘤内在状态则呈协调的代谢与生存适应，增殖性腺癌与小细胞簇汇聚于复制应激与细胞周期程序，氧化还原适应鳞癌状态伴谷胱甘肽生物合成与戊糖磷酸活性增强及NTRK2与BDNF表达；该架构跨疾病的重复出现提示转录状态可补充组织学来源以定义肿瘤生物学。图谱亦可通过识别候选靶点程序富集的转录背景为功能后续研究提供路线图，KIT、RET、DLL3、NTRK2、MET与ROS1等潜在可操作转录本的空间受限表达提出治疗假设，但需功能验证；混合诊断区域在生存分析中显示转录定义亚区结局可不同，提示图谱位置有助于未来队列分层假设生成，前瞻性应用中肿瘤落入MD区域可提示病理复核；兼容的患者转录组可投影至参考图谱以细化分子亚诊断、解读疑难病例并与分子注释区域比较；同一框架可评估实验模型，配对SRT与PDX坐标紧密对齐支持移植中转录身份保留；图谱经Oncoscape提供，使研究者可查询基因或通路并可视化其跨肺癌状态的空间分布。局限性包括：每例肿瘤仅由单一bulk RNA-seq谱代表，压缩了瘤内转录异质性；多研究多中心整合引入技术变异，虽经统一处理与批次校正仍不能完全排除残余混杂；RNA定义图谱尚未作为基于免疫组织化学（IHC）的病理工作流验证，簇身份不应仅凭候选IHC标志物在常规病理实践中判定；生存分析应视为假设生成而非可临床部署预后分类器的验证，模型区分度有限且未与纳入统一可得分期、体能状态、治疗、治疗年代与肿瘤基因型的完整临床模型对标。研究结论：该统一肺癌图谱表明组织学类别与保守的肿瘤内在轴及免疫轴相交织，通过将这些状态组织于单一参考框架内，该图谱为跨肺癌的生物学解读、模型评估与假设生成提供资源。
