人类内耳类器官中突触蛋白亚细胞定位的时间变化再现 ribbon 突触发育

《Stem Cell Reports》：Temporal changes in subcellular localization of synaptic proteins in human inner ear organoids recapitulate ribbon synapse development

Ribbon突触是内耳机械敏感毛细胞将机械刺激转换为感觉神经元电信号的关键结构，对精确且持续性的神经传递至关重要。在毛细胞发育过程中，突触ribbon体积增大而数量减少，同时与ribbon锚定的突触囊泡数量增加，突触蛋白在活性区附近聚集。目前尚不清楚类器官模型中的ribbon突触是否能再现体内ribbon突触发育的动态变化。本研究采用三维高分辨率成像技术，证明CTBP2阳性突触前ribbon在人内耳类器官毛细胞成熟过程中其数量、大小和形态呈现时间依赖性变化。此外，与毛细胞接触的神经突起数量随时间减少，提示投射精炼（projection refinement）。这些时间和形态学变化与小鼠毛细胞中ribbon突触的成熟过程一致，表明人源类器官毛细胞中存在等效的ribbon组装与精炼过程。

内耳毛细胞的ribbon突触（ribbon synapse）是一种特化的感觉突触，存在于视网膜、耳蜗及前庭器官的感觉受体细胞中，其通过电子致密结构——突触ribbon将突触囊泡锚定于精细纤维上，从而实现持续且不易疲劳的神经递质释放，这是感觉信号处理的核心环节。小鼠耳蜗内毛细胞中ribbon突触的发育与成熟已被广泛研究，其分子组装及结构与功能成熟发生在听力 onset 之前。尽管小鼠耳蜗研究积累了大量数据，但由于人内耳组织难以获取，人类内耳ribbon突触的组装过程知之甚少。虽然已在多能干细胞（PSC）来源的视网膜类器官中确认了ribbon突触的存在，但ribbon突触发育能否在人PSC来源的内耳类器官模型中被再现仍不明确。在小鼠和人PSC来源的内耳类器官中，大多数毛细胞表现出与II型前庭毛细胞一致的形态学、生物化学和功能特性。此外，类器官中可产生感觉样双极神经元并与类器官毛细胞形成物理接触。因此，开展本研究以检验人PSC来源内耳类器官是否表现出ribbon突触的时间依赖性发育与精炼，并研究与之相关的神经元投射精炼和突触修剪过程。

研究人员利用PAX2-2A-nGFP/POU4F3-2A-ntdTomato人胚胎干细胞（hESC）报告细胞系及mND2-0人诱导多能干细胞（iPSC）系，按照既往方案经多阶段诱导生成人内耳类器官，并在分化第80、120、160和200天（d80、d120、d160、d200）取材。关键技术方法包括：组织透明化（tissue clearing）结合全铺片免疫荧光，对突触前ribbon标记物CTBP2、ribbon支架蛋白PICCOLO、活性区锚定蛋白BASSOON、突触后谷氨酸受体2（GLUR2）、毛细胞标记物POU4F3和PCP4以及神经元标记物TUJ1进行三维（3D）共聚焦成像与重建；膨胀显微术（expansion microscopy）实现约4倍物理膨胀以突破共聚焦分辨率极限（约70 nm）；利用Imaris和NIS Elements软件进行CTBP2阳性 puncta 的数量、体积、球形度、圆度及共定位的定量分析；重新分析已发表的d109内耳类器官POU4F3阳性细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GEO: GSE200629）以确认突触前蛋白基因表达。

结果部分：（1）类器官毛细胞发育过程中CTBP2阳性 puncta 形态学的时间变化——研究人员证实POU4F3阳性细胞自d36左右出现，每个POU4F3阳性细胞具有长尖状毛束，扫描电镜显示阶梯状静纤毛排列；scRNA-seq分析确认CTBP2、SNAP25、KIF3A、PCLO、RAB3B、SLC17A8和BSN等突触前蛋白基因在毛细胞簇中高表达，且几乎所有CTBP2阳性 puncta 均表达PICCOLO。定量分析显示，每个毛细胞的CTBP2阳性 puncta 数量从d80至d120显著增加，d160后下降（d80: 3.482 ± 0.506；d120: 10.090 ± 0.821；d160: 4.009 ± 0.402；d200: 4.742 ± 0.482）；puncta 平均体积从d80至d120显著增大，d120后保持稳定；圆度分析显示d80时puncta 高度圆形，d120起变为椭圆形；puncta 平均强度随体积增大而增加。cleaved caspase-3免疫荧光未见明显阳性信号，排除了细胞凋亡对测量的影响。（2）膨胀显微术验证CTBP2阳性 puncta 数量的时间变化——膨胀后分辨率约70 nm，d160每个毛细胞的CTBP2阳性 puncta 数量显著低于d120（d120: 10.29 ± 0.94；d160: 4.76 ± 0.37），与共聚焦结果一致，提示ribbon前体生成后多余ribbon体被消除。高分辨率成像将CTBP2阳性 puncta 分为小、球形、短杆状和长杆状四种亚型，d80至d200各亚型分布比例基本不变；小亚型核心强度较低，类似小鼠耳蜗发育中新形成的前体样ribbon，且偶见小前体样puncta附着于长杆状puncta，提示前体融合为成熟ribbon。（3）CTBP2与BASSOON共定位提示成熟ribbon锚定于活性区——小亚型中BASSOON相关puncta比例从d80的18%随时间下降至d200的0%；而大多数长杆状puncta在d80至d200期间均与BASSOON相关，且长杆状亚型中CTBP2阳性/BASSOON阳性双阳性比例增加，提示成熟ribbon体在较晚发育阶段更倾向于锚定于活性区。（4）CTBP2阳性 puncta 与GLUR2共定位随毛细胞成熟增加——CTBP2阳性 puncta 与GLUR2共定位比例从d80的9.3%增至d200的27.0%，提示GLUR2在毛细胞发育成熟过程中被招募至与CTBP2阳性ribbon相邻的突触后终末。（5）与毛细胞接触的神经突起数量随时间减少——TUJ1阳性神经突起早在d40即可观察到，每个毛细胞的神经接触数在d80和d120之间维持稳定，d120后显著下降（d80: 2.700 ± 0.119；d120: 2.755 ± 0.097；d160: 1.459 ± 0.065；d200: 1.296 ± 0.055），提示通过突触修剪发生投射精炼。

讨论部分总结：本研究利用纵向形态学分析结合三维重建高分辨率成像，证明人内耳类器官中代表突触前ribbon的CTBP2阳性 puncta 在毛细胞成熟过程中其数量、大小和形状发生时间依赖性变化；每个毛细胞CTBP2阳性 puncta 数量在d120达峰后下降，而CTBP2阳性面积从d80至d200持续增加；膨胀显微术证实了ribbon大小和形状的时间变化；CTBP2与BASSOON的部分共定位提示ribbon被招募至毛细胞活性区；与CTBP2 puncta 数量延迟达峰不同，每个毛细胞的神经接触数在d80和d120最高，d120至d160显著下降。类器官毛细胞中CTBP2 puncta 计数、形状变化和神经接触计数的时序与小鼠耳蜗内毛细胞一致，提示类器官毛细胞中的ribbon突触经历了与小鼠内耳天然毛细胞相似的组装与成熟结构变化。研究人员还观察到支持神经元接触与精炼（即神经修剪）的证据。研究指出，哺乳动物II型前庭毛细胞含有圆形和 elongated rod-like ribbon 的异质性群体，本研究观察到的ribbon亚型异质性与哺乳动物ribbon多形性一致。与小鼠耳蜗内毛细胞成熟过程中大多数ribbon附着于活性区不同，CTBP2阳性 puncta 类型分布在d80至d200保持恒定，类似小鼠II型前庭毛细胞中观察到的趋势，提示成熟ribbon锚定于活性区而未成熟ribbon前体持续生成并保持游离。此外，神经支配毛细胞的峰值先于推定ribbon数量峰值，提示人内耳类器官毛细胞中神经元支配先于突触前特化和ribbon组装开始。研究局限性包括：未检查超微结构，未来需透射电镜验证；未通过延时活细胞成像监测CTBP2阳性 puncta 形态的动态变化；ribbon前体融合的验证有待未来利用CTBP2报告人PSC来源内耳类器官切片培养进行研究。研究结论翻译：本研究证明人内耳类器官毛细胞中的ribbon突触在毛细胞成熟过程中经历时间依赖性的数量、大小和形状变化，且与小鼠毛细胞中ribbon突触成熟过程一致，表明人源类器官毛细胞中存在等效的ribbon组装与精炼过程。