《Stem Cell Reports》：Optimized feeder-dependent culture enables efficient hypothalamic-pituitary organoid induction from human pluripotent stem cells
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人多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）来源的下丘脑-垂体类器官在体外重现垂体发育的关键过程，其中下丘脑谱系与口腔外胚层谱系之间的细胞相互作用对类器官形成至关重要。然而，hPSC的维持培养条件如何影响谱系特化过程仍不清
人多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）来源的下丘脑-垂体类器官在体外重现垂体发育的关键过程，其中下丘脑谱系与口腔外胚层谱系之间的细胞相互作用对类器官形成至关重要。然而，hPSC的维持培养条件如何影响谱系特化过程仍不清楚。在此，研究人员证明饲养层依赖的培养条件在类器官形成过程中决定性决定谱系特化。在SNL饲养层上维持的hPSC优先分化为口腔外胚层细胞，而在MEF饲养层上维持则有利于下丘脑谱系。将SNL和MEF维持的hPSC共培养或组合其条件培养基可有效平衡这些谱系，提高垂体诱导效率。此外，稳定的FGF2突变体实现了“周末免”方案，在保持高分化效率的同时减少了劳动和成本。研究结果强调了维持条件以及下丘脑-口腔外胚层相互作用在垂体发育中的重要性，为高效且可重复地生成下丘脑-垂体类器官建立了稳健平台。
多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞（iPSCs），人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）因具有无限自我更新能力并可分化为三个胚层，成为再生医学和发育研究的重要工具。垂体发育依赖于下丘脑与口腔外胚层之间的相互作用，近年来基于三维类器官培养的下丘脑-垂体类器官（hypothalamic-pituitary organoids, HPOs）能够部分重现胚胎期垂体发育过程，但其诱导效率在不同实验间不一致，原因尚不明确。已有研究多采用无饲养层体系，但不同维持培养条件对hPSC后续向特定谱系分化能力的影响仍不清晰。为此，研究人员系统探讨了hPSC维持培养条件对HPO诱导效率的影响，发现饲养层细胞类型显著决定类器官形成过程中的谱系特化方向，并通过优化饲养层组合与培养基成分建立了更高效、可重复的诱导方案。这一研究为垂体发育机制研究和疾病模型构建提供了可靠平台。
研究人员采用三株人iPSC系：201B7和409B2均来源于人皮肤成纤维细胞，HC06#4来源于外周血单核细胞，均通过质粒重编程建立。主要技术方法包括：在不同维持条件下培养hPSC后，利用V形底板形成拟胚体，并以BMP4和SAG诱导下丘脑-垂体类器官；通过免疫染色评估谱系标志物；使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）和液滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）定量基因表达；利用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离GFP标记与未标记细胞；通过电化学发光免疫分析测定培养上清中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone, ACTH）浓度。
**不同维持培养条件对HPO诱导的影响**：研究人员将201B7细胞分别在SNL饲养层、无饲养层条件（AK02N、mTeSR1和Essential 8）下维持后诱导HPO。免疫染色显示，所有条件下均能形成NKX2-1+下丘脑样细胞和E-cadherin+口腔外胚层样细胞，但仅饲养层条件下出现下丘脑区室与口腔外胚层区室的紧密并列，并检测到LHX3+垂体祖细胞；RT-qPCR证实饲养层条件下NKX2-1、PITX1和LHX3表达最稳定且最高。在409B2和HC06#4两株细胞中进一步验证，无饲养层条件均无法支持LHX3+细胞生成。
**饲养层细胞类型对HPO诱导的影响**：比较SNL-与MEF-维持的hiPSCs（SNL-hiPSCs和MEF-hiPSCs），发现SNL-hiPSCs优先分化为E-cadherin+口腔外胚层细胞，而MEF-hiPSCs更高效生成RAX+下丘脑细胞。RT-qPCR和免疫染色进一步显示，MEF-hiPSCs偏向神经外胚层、神经视网膜和下丘脑前体谱系，SNL-hiPSCs则偏向非神经外胚层和口腔外胚层谱系。但FGF8和FGF10的表达水平与下丘脑标志物之间无一致相关性。
**SNL-和MEF-维持hiPSC来源细胞间的相互作用促进垂体类器官中的平衡分化**：将GFP标记的SNL-hiPSCs与未标记的MEF-hiPSCs等量混合后诱导，FACS分选和ddPCR分析显示，嵌合类器官中GFP+和GFP?细胞均表达相似水平的RAX、PITX1和LHX3；免疫染色证实两种来源的细胞均贡献于RAX+/NKX2-1+下丘脑细胞、E-cadherin+口腔外胚层细胞和LHX3+垂体祖细胞，提示饲养层依赖的分化偏好并非固定，可通过细胞间相互作用加以调节。
**饲养层预混合条件平衡下丘脑和口腔外胚层分化**：为简化操作，研究人员将SNL和MEF以1:1比例预混合作为饲养层维持hiPSCs。由此产生的类器官中，EpCAM+垂体谱系区域与RAX+下丘脑区域的比例介于单独SNL和单独MEF之间；在多种iPSC系中，预混合条件均提高LHX3+垂体祖细胞诱导效率。进一步优化SNL:MEF比例发现，3:1至1:1的混合比例最有利于LHX3+细胞生成。
**饲养层细胞的旁分泌效应影响hPSC向垂体谱系分化**：使用SNL条件培养基（SNL-CM）、MEF条件培养基（MEF-CM）及二者混合条件培养基（mixed-CM）在Matrigel上维持hiPSCs，这些细胞也能分化为LHX3+细胞和ACTH+细胞。但与直接饲养层共培养相比，条件培养基条件下SNL和MEF谱系偏好减弱。研究还发现，MEF比SNL粘附性更强，分化起始时残留的MEF可能通过与口腔外胚层分化的直接抑制作用而降低垂体诱导效率。
**“周末免”下丘脑-垂体类器官诱导方案的开发**：利用稳定型FGF2突变体FGF2-G3替代碱性FGF（basic FGF, bFGF），将维持培养换液频率从每天一次降至每周三次。该方案可长期维持多能性标志物表达，并支持HPO诱导，分化产生的类器官在第39天表达RAX、NKX2-1、PITX1和LHX3；延长培养至第103天可获得ACTH+激素产生细胞，且在促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）刺激下ACTH分泌水平与常规方案无显著差异。
讨论部分指出，无饲养层条件下HPO诱导效率在研究人员手中不稳定，而使用饲养层或条件培养基可支持分化，提示饲养层来源的可溶性因子可能增强hPSC的分化潜能；但直接细胞接触对谱系偏好的影响更为明显。SNL和MEF诱导的不同谱系偏好可通过混合策略加以平衡，从而强化下丘脑-口腔外胚层相互作用对垂体发育的重要性。研究结论可翻译为：在本研究中，通过优化PSC维持条件，研究人员建立了一种改良方案，该方案减少了换液频率，同时支持类器官内下丘脑和口腔外胚层区室之间的相互作用。在这些条件下，分化结果在实验设置中更为一致。该方案预期将提高垂体分化模型在人类发育和疾病研究中的实用性。
