碱基编辑介导的弓形虫（Toxoplasma gondii）精准基因组工程：首个腺嘌呤碱基编辑器（ABE）与胞嘧啶碱基编辑器（CBE）平台的建立及i-Silence与i-STOP策略的应用

《PLOS Pathogens》：Base editing-mediated precision genome engineering in Toxoplasma gondii

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种具有全球重要医学意义的专性细胞内寄生原虫，其功能基因组学研究主要依赖CRISPR-Cas9介导的基因敲除。然而，传统的CRISPR-Cas9编辑依赖双链断裂（double-strand breaks, DSBs），其修复要么通过易出错的非同源末端连接（non-homologous end joining），要么通过需要供体模板且克隆分离耗时的同源定向修复（homology-directed repair）。本研究首次在弓形虫中建立了两个碱基编辑平台：腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editors, ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editors, CBEs），二者通过直接碱基转换实现精确的位点突变，无需双链断裂或供体模板。研究人员成功利用ABE和CBE在确定的基因组位点引入高效率的A > G和C > T碱基转换。通过靶向关键毒力基因ROP18，研究人员证明ABE介导的i-Silence（起始密码子破坏）和CBE-mediated i-STOP（提前终止密码子引入）策略可高效产生功能缺失的弓形虫突变株。所得碱基编辑虫株完全丧失ROP18蛋白表达，其毒力减弱和增殖表型与常规ROP18敲除株相当，这一结论在细胞模型和小鼠模型中均得到验证。随后，研究人员通过全基因组分析预测，i-Silence和i-STOP策略能够靶向灭活弓形虫基因组中几乎所有基因（>99.6%覆盖率）。由于本方法不依赖双链断裂，研究人员得以在不发生染色体重排风险的前提下实现高效、精确的核苷酸替换。研究人员提出，碱基编辑是弓形虫中一种强大的遗传工具，为高分辨功能致病机制研究和基因稳定减毒疫苗的进一步开发铺平了道路。

【研究背景与问题】弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛流行的专性细胞内顶复门（Apicomplexa）寄生虫，估计全球30%–50%人口呈血清阳性，可通过先天性传播对免疫受损个体和胎儿造成严重威胁，但其致病、免疫逃逸与阶段转换的分子机制仍未完全阐明。近二十年来，弓形虫遗传操作已从依赖正负筛选标记的同源重组（劳动密集、耗时漫长）发展至CRISPR-Cas9技术，实现了快速基因敲除。然而，传统CRISPR-Cas9依赖双链断裂（double-strand breaks, DSBs），修复依赖易出错的非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ），或需要外源供体模板且克隆分离耗时的同源定向修复（homology-directed repair, HDR），并可引发不可预测的插入缺失（indels）、染色体重排、大片段删除和细胞毒性，且精确点突变效率不稳定。这些局限阻碍了单核苷酸水平基因功能微调、致病性单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）模拟及药物靶点耐药突变验证等应用。碱基编辑（Base editing, BE）将催化失活的Cas9 nickase与脱氨酶融合，无需双链断裂即可实现C > T或A > G碱基转换，已在细菌、人类疾病模型、植物和利什曼原虫中应用；基于BE的i-STOP与i-Silence基因失活策略虽已在其他生物体中实施，其在弓形虫中的应用尚属空白。

【研究内容、结论与意义】研究人员构建了经弓形虫优化的ABE（ABE8e）和CBE（YE1-BE3）表达质粒，首次建立了功能性碱基编辑平台；以关键毒力因子ROP18为概念验证，证明ABE介导的i-Silence与CBE介导的i-STOP可高效灭活ROP18，所得虫株表型与传统敲除株不可区分；全基因组分析显示两种策略可靶向弓形虫99.96%以上的蛋白编码基因。该研究为功能基因组学、药物靶点验证和疫苗开发提供了稳健、可扩展、精确的遗传工具，并为其他顶复门寄生虫的精准基因组工程提供了原理验证。

【关键方法】本研究以ME49株弓形虫为样本（在人包皮成纤维细胞HFF中维持），利用靶向ROP16和ROP18位点的sgRNA评估ABE（ABE8e）与CBE（YE1-BE3）的编辑效率，采用Sanger测序与Illumina NovaSeq 6000扩增子深度测序（ROP18-ABE样本经Oxford Nanopore PromethION 2 Solo平台测序）结合CRISPResso2分析，并以CRISPOR预测脱靶位点；通过免疫印迹、空斑实验、细胞内增殖实验、6周龄雌性C57BL/6小鼠毒力实验（每组5只）、脑包囊计数、TgB₁基因qPCR及流式细胞术验证表型；基于ME49参考基因组（GCF_000006565.2），使用iSTOP R包与定制Python脚本评估7种ABE变体的PAM类型与编辑窗口，完成全基因组i-STOP与i-Silence靶点分析。

【研究结果】
BE系统促进弓形虫碱基转换：免疫印迹证实碱基编辑蛋白在速殖子中高效表达；Sanger测序显示CBE转换效率为23%–87%，ABE为35%–100%，扩增子深度测序给出了更精确的量化（CBE 26.9%–81.7%，ABE 32.1%–94.2%），且旁观者编辑（bystander editing）频率极低。
BE介导的ROP18基因破坏：i-Silence（ATG > GTG）与i-STOP（CAG > TAG）单克隆的靶位点替换频率分别达99.32%和98.76%，未检测到未编辑序列；免疫印迹显示三种突变株ROP18蛋白完全缺失；前5个预测脱靶位点无可检测脱靶编辑（检测下限为0.0028%）。
BE介导的ROP18破坏减弱弓形虫毒力：三种突变株感染小鼠30天内存活率均为100%（WT组自第8天起下降，终末存活率40%），脑包囊数与虫荷均显著减少；胞内增殖实验显示含≥16个虫体的空泡几乎消失，空斑面积显著缩小；Neuro-2a细胞凋亡诱导率降至23%–26%（WT为43.3%±2.7%），与ROP18敲除株无显著差异。
i-STOP与i-Silence全基因组靶点检测：8,154个开放阅读框（ORFs）分析显示，99.96%蛋白编码转录本可被i-STOP靶向，87.58%的CAA、CAG、CGA和TGG密码子可被精确转换为终止密码子；i-Silence可靶向7,998个基因（98.07%），7,995个基因两策略均可靶向，3个基因仅i-Silence可靶向、157个仅i-STOP可靶向，表明两策略互补。

【讨论总结】讨论指出，本研究是碱基编辑在弓形虫中的首次功能性应用，实现了无双链断裂的无痕精确基因灭活，最大限度降低了染色体重排风险，对减毒活疫苗研发（现有唯一商品化疫苗Toxovax仅用于羊）具有重要安全性意义；与传统CRISPR敲除文库相比，碱基编辑无需为每个基因使用筛选标记，可实现高通量池化筛选。但研究亦存在局限：编辑效率依赖转染效率且因基因和sgRNA序列而异，编辑窗口受限并存在旁观者编辑，RNA脱靶效应未评估，且仅功能验证了ROP18一个基因。未来方向包括采用放宽PAM要求的SpRY/SpG Cas9变体、密码子优化、药物诱导型编辑系统，以及尚未在弓形虫中开发的先导编辑（Prime editing, PE）技术，并将该框架推广至疟原虫等其他顶复门寄生虫。

【研究结论】总之，研究人员验证了碱基编辑是一种精确高效的遗传工具，可作为传统方法的强大替代，为基础研究、药物发现和疫苗开发提供了重要平台，奠定了精确遗传操作以加速弓形虫基础与转化研究的基础。