《eBioMedicine》：Epigenetic age acceleration in the brain and blood of people with epilepsy and in a mouse model of focal cortical dysplasia: a retrospective cross-sectional study
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Background
癫痫患者的预期寿命缩短，且年龄相关合并症负担更高，提示其与更快的生物衰老（biological ageing）存在关联。然而，直接的分子证据一直稀缺。
Methods
研究人员将基于DNA甲基化的表观遗传时钟（epigenetic cl
Background
癫痫患者的预期寿命缩短，且年龄相关合并症负担更高，提示其与更快的生物衰老（biological ageing）存在关联。然而，直接的分子证据一直稀缺。
Methods
研究人员将基于DNA甲基化的表观遗传时钟（epigenetic clock）应用于324名结构性或遗传性癫痫患者及65名非癫痫对照的大脑（brain）和血液（blood）样本，并应用于一个产前宫内电穿孔（in utero electroporation, IUE）小鼠模型（人类FCD 2型的体细胞mTOR通路激活等效模型），该模型在癫痫发作前和发作后进行采样。表观遗传年龄加速（epigenetic age acceleration）定义为对实际年龄、性别、细胞类型和芯片阵列（array）类型进行稳健回归后的残差。在小鼠模型中测量相对端粒长度（relative telomere length）以独立验证生物衰老。
Findings
在大脑中，表观遗传年龄加速在不同结构性病变类型中表现一致（中位数+7.3年，p < 0.0001），在神经节细胞胶质瘤（ganglioglioma, GG）中最为显著（+10年，adj. p < 0.0001），其次是轻度皮质发育不良伴少突胶质细胞增生在癫痫中（mild malformation of cortical development with oligodendroglial hyperplasia in epilepsy, MOGHE）（+8.1年，adj. p < 0.0001）、伴海马硬化的颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis, TLE）（+6.6年，adj. p < 0.001）和局灶性皮质发育不良（focal cortical dysplasia, FCD）（+5.6年，adj. p < 0.001）。在血液中，校正细胞组成、年龄和性别后，年龄加速不显著（中位数+0.7年，p = 0.20），除FCD外（+2.3年，adj. p < 0.05）。在结构性癫痫中，大脑的年龄加速大于血液（中位数+7.3 vs +1.4年，p < 0.0001）。可用的丙戊酸（valproic acid, VPA）暴露数据（n = 175）与年龄加速无显著关联。在药物初治的mTOR小鼠模型中，突变癫痫大脑但非血液显示年龄加速（adj. p < 0.05）。在癫痫发作前的潜伏期（latency）大脑中已可检测到衰老特征，并得到相对端粒长度缩短的独立支持（adj. p = 0.05），表明生物衰老可先于明显的癫痫。
Interpretation
耐药性结构性癫痫中癫痫大脑的表观遗传衰老加速是一致特征，是疾病修饰的候选通路。系统性衰老的贡献仍未解决，需要进一步测试其在其他病因中的可推广性。
癫痫（epilepsy）是最常见的严重慢性神经系统疾病之一，全球约1%人口受累，约30%患者对现有抗癫痫药物（antiseizure medication, ASM）耐药。流行病学研究显示，癫痫患者预期寿命缩短超过十年，且痴呆、脑血管和心血管疾病、糖尿病、慢性肺病、关节炎和骨质疏松等年龄相关合并症发生率更高，提示癫痫可能与生物衰老（biological ageing）加速存在关联。既往研究虽已在人类及实验性癫痫中描述DNA甲基化改变及其他表观遗传变化，并发现分子和细胞层面的衰老特征，但缺乏基于DNA甲基化表观遗传时钟（epigenetic clock）的直接量化证据；同时，这种衰老究竟是脑组织特异性还是系统性、是否先于癫痫发作出现，均不清楚。为回答这些问题，研究人员整合跨物种、跨组织的人类队列与机制性小鼠模型，首次系统评估了不同结构性病因癫痫、遗传性癫痫及FCD小鼠模型中的表观遗传年龄加速，为理解癫痫相关过早死亡和多重合并症的分子基础提供了新视角，并将衰老相关通路确立为潜在的疾病修饰干预靶点。
研究人员首先采用物种特异性Illumina BeadChip平台对人类和小鼠脑与血液样本进行全基因组DNA甲基化（DNA methylation）谱分析，经noob背景校正与染料偏向归一化，并通过基于参考的细胞类型去卷积（神经元/胶质细胞比例采用HiBED包估计，白细胞亚型采用EpiDISH包推断）校正细胞异质性。生物年龄预测采用主成分版Horvath全组织时钟（PCHorvath1）及基于347个CpG位点的鼠源时钟；年龄加速定义为预测年龄对实际年龄、性别、估计细胞比例和芯片类型（人类）或仅实际年龄（小鼠）进行稳健线性回归后的标准化残差。机制验证通过宫内电穿孔（IUE）在野生型C57BL/6小鼠中构建体细胞mTOR突变（mTOR
mt）模型，经皮层电极植入和视频-EEG监测区分潜伏期（latency）与癫痫期；进而采用WGCNA进行加权基因共甲基化网络分析，并经ReactomePA实施通路富集分析。样本队列涵盖162例结构性癫痫手术脑组织、20例非癫痫尸脑对照、186例癫痫血液样本（含结构性与遗传性）、45例血液对照及30只小鼠。
**人类癫痫脑中的加速生物衰老**
对162例药物难治性结构性癫痫患者（FCD n=52，MOGHE n=48，TLE n=32，GG n=30）及20例非癫痫尸脑对照的分析显示，所有结构性癫痫组的表观遗传年龄加速均显著高于对照（中位数+7.3年，p < 0.0001）。其中GG加速最显著（+10年，adj. p < 0.0001），其次为MOGHE（+8.1年，adj. p < 0.0001）、TLE（+6.6年，adj. p < 0.001）和FCD（+5.6年，adj. p < 0.001）。部分GG和MOGHE患者残差高达+40年。在经两位神经病理学家独立确认的组织学正常颞叶新皮层中亦观察到加速，表明该效应并非仅由显性病灶病理所致。脑年龄加速与癫痫发病年龄显著相关（Spearman ρ = 0.22，p < 0.01），但与病程无关（ρ = ?0.145，p = 0.07）。
**癫痫血液中的加速生物衰老**
对186例癫痫（结构性与遗传性）和45例对照血液样本的分析显示，总体上癫痫血液年龄加速不显著（中位数+0.7年，p = 0.20）。仅FCD血液组显示显著加速（+2.3年，adj. p < 0.05），而MOGHE、TLE及各类发育性和癫痫性脑病（developmental and epileptic encephalopathy, DEE；包括STXBP1、SCN1A、SCN2A、SCN8A和KCNQ2相关）均未达显著水平。跨组织比较显示，在结构性癫痫中大脑年龄加速显著高于血液（中位数+7.3 vs +1.4年，p < 0.0001），并在同一患者配对脑-血样本中得到验证（n=24，p < 0.01）。在FCD内部，大脑亦显著高于血液（adj. p < 0.05），尽管在配对亚组（n=10）中差异未达显著（p = 0.43）。FCD血液年龄加速与发病年龄（ρ = 0.537，p < 0.0001）和病程（ρ = 0.857，p < 0.0001）显著相关，但作者指出病程与实际年龄存在严重共线性，应视为探索性结果。
**跨物种一致的加速生物衰老**
在IUE mTOR
mt突变小鼠模型中，癫痫期（P80）小鼠大脑显示显著年龄加速（adj. p < 0.05），而匹配血液无显著差异（adj. p = 0.34）。潜伏期（P42）小鼠大脑未显示一致的年龄加速，但部分动物已出现可检测的衰老相关甲基化改变。独立验证指标相对端粒长度在癫痫小鼠脑中显著缩短（adj. p < 0.01），潜伏期呈缩短趋势（p = 0.05），且与表观遗传年龄显著负相关（ρ = ?0.56，p < 0.05）。癫痫小鼠脑年龄加速与总发作次数、累积发作负荷或发作频率无显著相关，潜伏期小鼠的脑衰老与棘波数量亦无显著相关，但这些分析检验效能不足。
**衰老与癫痫的汇聚分子特征**
基于小鼠脑DNA甲基化的WGCNA鉴定出7个共甲基化模块。两个模块（黄色和棕色）与癫痫显著相关并与对照呈负相关，棕色和绿松石模块与年龄显著相关。通路分析显示，三个模块共同汇聚于RTK（receptor tyrosine kinase，受体酪氨酸激酶）和RHO家族小GTP酶信号、轴突导向及神经系统发育。癫痫特异性（黄色）模块额外突出活动依赖性信号、细胞骨架重塑和凋亡；癫痫与年龄共有（棕色）模块突出突触传递；年龄特异性（绿松石）模块则更广泛涉及PI3K/AKT信号、细胞外基质重塑、神经炎症、TLR（Toll-like receptor，Toll样受体）信号及离子稳态。值得注意的是，潜伏期P42和P80 mTOR突变非癫痫小鼠的甲基化谱已类似对照或癫痫动物，提示脑DNA甲基化特征可能作为癫痫发生（epileptogenesis）的早期生物标志物。
讨论部分确认，表观遗传年龄加速是耐药性结构性癫痫人脑的一致特征，且跨越多种结构性病因和mTOR驱动的小鼠模型；血液中的外周效应较为有限且呈病因依赖性，FCD是唯一在脑和血中均显示显著加速的结构性癫痫亚型，提示该病因可能存在系统性参与，但也可能反映检测灵敏度不足或样本量局限。由于人源数据为回顾性横断面设计，无法确定衰老变化与癫痫发生的时序关系，因此采用病因匹配的小鼠模型进行验证。药物初治小鼠在癫痫发作前即表现出年龄加速和端粒缩短，证明抗癫痫药物和反复癫痫发作并非其出现的必要条件。然而，两个采样时间点无法区分年龄加速是逐渐、突然还是动态发展，也无法确定早期衰老是后续癫痫的必要或充分条件。WGCNA结果提示癫痫与衰老汇聚于重叠的可塑性相关网络，但偏向不同：癫痫倾向不良回路重塑，衰老则增加对回路可塑性的限制。作者强调，表观遗传时钟估计值受回顾性对照年龄分布不匹配的影响，人类脑加速幅度应视为近似值。丙戊酸暴露与年龄加速无显著关联，且GG患者VPA暴露最低但加速最严重，降低了药物作为主要混杂因素的可能性，但不完全排除残余混杂。研究人群主要为欧洲裔，样本量由组织可得性而非先验效能计算决定，较小亚组的阴性结果应视为不确定而非无效证据。总体而言，表观遗传年龄加速为癫痫中年龄相关疾病负担提供了分子关联，但仍需纵向、细胞类型分辨率及机制性研究以确立因果关系和治疗潜力。
研究结论指出，耐药性结构性癫痫患者脑组织表现出一致的加速生物衰老，且这一现象跨越多种人类结构性病变类型和mTOR驱动的小鼠模型；相比之下，所检测的遗传性癫痫在血液组中未显示可比的全组水平加速。跨组织分析显示，衰老效应在脑组织中通常强于血液，其中局灶性皮质发育不良是唯一在两种组织中均表现出类似年龄加速的亚型，提示该病因可能存在系统性衰老。通过在癫痫发作前和发作后对mTOR驱动模型进行采样，研究人员鉴定出在某种程度上已存在于部分动物潜伏期的表观遗传衰老特征和癫痫相关甲基化模块，提示加速的表观遗传衰老可先于明显的癫痫发生。这些数据通过以癫痫亚型和组织分辨率提供生物年龄加速的定量测量指标，拓展了既往癫痫表观遗传失调的证据，并与癫痫患者过早死亡和多重合并症的的临床观察一致。
