《Metabolomics》：Untargeted serum and cerebrospinal fluid metabolomics of apparently healthy rabies virus-positive dogs in Nigeria
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狂犬病仍是一种具有全球重大公共卫生意义的被忽视人兽共患疾病，其根本原因在于该病近乎普遍致死、可靠的生前（antemortem）诊断选择有限以及临床体征出现后缺乏有效治疗。然而，对表面健康但狂犬病病毒阳性的犬只所表现出的代谢改变目前仍缺乏表征。因此，本研究旨在鉴
狂犬病仍是一种具有全球重大公共卫生意义的被忽视人兽共患疾病，其根本原因在于该病近乎普遍致死、可靠的生前（antemortem）诊断选择有限以及临床体征出现后缺乏有效治疗。然而，对表面健康但狂犬病病毒阳性的犬只所表现出的代谢改变目前仍缺乏表征。因此，本研究旨在鉴定直接免疫荧光试验（direct fluorescent antibody, DFA）阳性的表面临床健康犬与DFA阴性犬相比的差异丰度代谢物。研究方法：样本采集自231只表面临床健康犬的脑组织、血清及脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）。采用直接免疫荧光试验（DFA）检测脑组织中的狂犬病病毒抗原，并依据检测结果将犬只分为狂犬病阳性或阴性。使用经验证的非靶向代谢组学样本制备流程提取血清和CSF中的代谢物。代谢谱分析在优化的分析条件下采用全二维气相色谱-飞行时间质谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry, GC×GC-TOFMS）完成。研究结果：在231份脑组织样本中检出20份狂犬病病毒抗原阳性（8.7%）。相应的血清和CSF样本被归类为狂犬病（DFA）阳性，同时选取20份阴性样本用于比较。经质量控制后，血清中保留868种化合物，CSF中保留300种化合物。主成分分析（principal component analysis）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis）均无法区分任一样本基质中的组间。经错误发现率（false discovery rate, FDR）校正后，4个血清特征保持显著：Analyte 634、甘油酸（glyceric acid）和Analyte 634在DFA阳性犬中丰度降低，而苯甲酸（benzoic acid）升高。Analyte 634在发现集中的曲线下面积（area under the curve, AUC）最高（AUC = 0.9575）。在CSF中，一个未注释特征（Analyte 369）经FDR校正后在DFA阳性犬中丰度降低。血清Analyte 634与CSF Analyte 369的保留时间和质谱相同，可能为同一化合物。血清中富集p值最低的通路主要由甘油酸单独映射，且没有CSF通路在FDR校正后保持显著。在名义（nominal）水平上，吲哚乳酸（indolelactic acid）在DFA阳性犬的两种基质中均升高。研究结论：经FDR校正后，4个血清特征和1个CSF特征在表面健康DFA阳性犬与DFA阴性犬之间表现出差异。这些均为发现阶段的候选特征，在提出任何诊断学主张之前，需进行结构确证、靶向定量以及在独立队列中的验证。
**一、研究背景与问题提出**
狂犬病是一种被忽视的人兽共患疾病，在非洲和亚洲，家犬约占人类狂犬病病例的95%，每年导致全球约60000例相关死亡。由于狂犬病病毒属（Lyssavirus）病原能够逃避免疫系统攻击，生前诊断十分困难，感染通常只能在临床体征出现后才被确诊，而此时疾病已近乎必然致死。暴露后预防（post-exposure prophylaxis, PEP）联合狂犬病免疫球蛋白（rabies immunoglobulin, RIG）和疫苗是推荐的干预措施，但在尼日利亚农村，其高昂成本与有限可及性常使受害者转而依赖传统疗法。区分狂犬病犬与正常犬的咬伤本可减少不必要的PEP使用，但病毒的病理生理学使这一区分变得复杂。代谢组学作为新兴的"组学"技术已在传染病临床诊断中展现出前景，脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）和血清生物流体分析在神经系统疾病诊断中价值突出。然而，狂犬病相关代谢组学研究有限，且多针对实验室动物或已死亡犬只；对表面健康但病毒阳性犬只的代谢改变仍缺乏表征。为此，研究人员利用尼日利亚犬肉消费的习俗，在屠宰前从无明显临床体征的犬只采集样本，以DFA试验检测脑组织抗原为基础，比较DFA阳性犬与阴性犬的血清和CSF代谢谱差异，旨在鉴定差异丰度代谢物，为生前诊断提供初步线索。
**二、关键技术方法（约250字）**
样本队列来源于尼日利亚北中部高原州（Plateau State）的Dawaki犬市场和东南埃努古州（Enugu State）的Orie-Orba犬市场，共231只拟屠宰的Basenji犬，按性别、采样地点和年龄类别匹配选取20只阳性犬与20只阴性犬。脑组织经DFA试验（FITC标记单抗）检测病毒抗原；血清与CSF采用经验证流程提取代谢物（3-苯基丁酸内标、蛋白沉淀、甲氧胺肟化和含1% TMCS的BSTFA衍生化）；采用GC×GC-TOFMS分析，以NIST 20谱库（相似度≥80%）进行注释；数据经内标归一化、EigenMS批次效应校正、对数转换与Pareto标度，利用MetaboAnalyst 6.0完成PCA、PLS-DA、Mann-Whitney U检验、FDR校正、ROC分析及基于HMDB与犬（Canis lupus familiaris）KEGG通路的通路富集分析。
**三、研究结果**
研究人群特征：231只犬中20只（8.7%）脑组织DFA阳性，所有犬均为Basenji犬，排除了具有流涎、不协调、攻击性等临床体征的个体，直肠温度在正常生理范围内。
GC×GC-TOFMS分析结果：FAMES标准品重复进样显示分析期间仪器稳定性可接受，系统空白与提取空白显示仪器及试剂污染极小。
数据概览：血清数据集经清理后保留868种化合物（含415种未注释），CSF数据集保留300种化合物；两组缺失率无显著差异；PCA未显示任一组间分离，血清前两个主成分解释30.9%方差，CSF解释32.5%；PLS-DA同样未显示分离，交叉验证预测性能差（血清准确率0.65、Q
2=0.06、置换检验p=0.991；CSF Q
2=-0.13），提示组间仅存在细微代谢改变。
血清差异代谢物：火山图分析鉴定出60个名义差异化合物，FDR校正后4个显著，Analyte 634（FC=6.57）、甘油酸（FC=2.64）和Analyte 706（FC=6.43）在阳性犬中降低，苯甲酸（FC=0.31）升高；ROC分析显示四者发现集AUC均高于0.8425，其中Analyte 634最高（AUC=0.9575，95% CI：0.889–1.000）。
CSF差异代谢物：12个名义差异化合物中，仅Analyte 369（FC=7.15，raw p=1.1×10
-5，FDR=0.003）经FDR校正后显著且丰度降低；其AUC为0.9240（95% CI：0.801–1.000）。
通路分析：血清有10条通路FDR<0.05，但均由1–2个化合物单独映射（甘油酸），相对介数中心性通路影响值至多为0.097；CSF无通路在FDR校正后保持显著。
**四、讨论与结论**
研究人员指出，全局代谢谱无显著分离可能反映表面健康犬只系统代谢扰动细微、自由放养且营养状况各异的犬只组内生物学变异较大，或二者兼有。甘油酸降低可能与饮食、果糖或丝氨酸代谢或营养状态差异有关；苯甲酸升高可能源于饮食暴露（含苯甲酸钠防腐剂的食物），或狂犬病诱导的甘氨酸结合途径改变导致清除受损；血清Analyte 634与CSF Analyte 369的保留时间（1487 s和2.180 s）及质谱碎片（m
z 235基峰等）高度相似，可能为同一化合物。
研究结论（翻译）：本研究提供了关于表面健康DFA阳性及阴性Basenji犬血清和CSF代谢组中早期代谢改变的新见解。尽管DFA阳性组与阴性组之间的多变量差异极小，但单变量分析提示两个基质中均存在潜在的代谢扰动。经FDR校正后，4个血清特征（Analyte 634、甘油酸和Analyte 706在DFA阳性犬中降低，苯甲酸升高）和1个CSF特征（Analyte 369降低）保持显著。血清Analyte 634与CSF Analyte 369可能为同一化合物。由于血清通路结果主要依赖甘油酸、且没有CSF通路在FDR校正后显著，数据未确立任何代谢通路发生改变。上述发现为发现阶段候选特征，在考虑诊断应用之前，需经结构确证、靶向定量以及在独立且理想情况下纵向采样的队列中验证。
