《Metabolomics》：Development and systematic evaluation of an untargeted HILIC?HRMS metabolomics workflow for multi-matrix human samples analyses
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摘要：基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）被广泛应用于生物系统代谢改变的研究；然而，受代谢物化学多样性以及色谱和样品制备条件对分析性能影响所限，全面的代谢组表征仍具挑战性。
研究目标：本
摘要：基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）被广泛应用于生物系统代谢改变的研究；然而，受代谢物化学多样性以及色谱和样品制备条件对分析性能影响所限，全面的代谢组表征仍具挑战性。
研究目标：本研究旨在开发并系统优化一种非靶向HILIC-HRMS流程，以实现对血清、尿液和毛发等多种人源生物基质中极性代谢物（polar metabolites）的广泛且可重复的检测。
研究方法：研究人员在正离子（positive ionization）和负离子（negative ionization）两种模式下，利用代表性氨基酸和有机酸混合物对色谱条件进行了优化；采用8种溶剂体系和氘代内标（deuterated internal standards）评估回收率、重现性和代谢物覆盖度，对提取方法进行了评价；优化后的流程应用于24名健康志愿者收集的血清、尿液和毛发样本；代谢物注释（metabolite annotation）通过商用高分辨串联质谱库（HRMS/MS library）富集自建谱库（in-house library）后的光谱匹配（spectral matching）完成。
研究结果：优化后的方法在正离子模式下采用甲酸铵/甲酸（ammonium formate/formic acid）基流动相，负离子模式下采用碳酸氢铵（ammonium bicarbonate）基条件，并以甲醇（methanol）作为提取溶剂。该流程在所有基质中均表现出稳健的分析性能，在血清中鉴定出118种代谢物，尿液中196种，毛发中166种；共检测到12种代谢物超类（metabolite superclasses），其中65种为三种基质所共有；可比的化学类别分布表明该流程具有广泛的代谢物覆盖度，且类别特异性分析偏倚（class-specific analytical bias）极小。
结论：所提出的HILIC-HRMS流程为极性代谢物的非靶向代谢组学提供了稳健、可重现且可转移（transferable）的分析平台；其在血清、尿液和毛发中的适用性使其适用于以极性代谢物谱分析为焦点的大规模临床和转化医学研究。
研究背景
非靶向代谢组学已成为探究生理过程、疾病机制及环境暴露相关代谢改变的重要分析手段。基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的平台凭借高灵敏度、广覆盖与结构解析能力成为主流选择，但代谢物化学多样性极强、浓度跨度大，且代谢物可检测性高度依赖色谱分离、样品制备与数据处理策略，使全面代谢组表征仍具挑战。其中，亲水相互作用色谱（HILIC，一种以亲水固定相分离强极性化合物的液相色谱模式）对氨基酸、核苷酸、有机酸等极性代谢物覆盖良好，但其性能对流动相组成、缓冲体系与进样溶剂兼容性极为敏感，已有优化研究多局限于单一基质、单一极性或靶向代谢物面板，难以直接推广至多基质非靶向流程。同时，现有方法常针对特定基质优化，因蛋白含量、盐浓度与代谢物组成的差异难以跨基质转移；毛发作为可反映长期代谢与环境暴露的新型基质，其代谢组学研究尤为缺乏。因此，开发并系统评价适用于多基质的HILIC-HRMS非靶向流程具有重要的方法学意义。
研究内容、结论与意义
研究人员围绕极性代谢物系统优化了正、负离子模式下的色谱条件、提取溶剂与复溶溶剂，并在血清完成精细优化后将流程推广至尿液与毛发。最终流程为：正离子采用含10 mM甲酸铵与0.2%甲酸的流动相（pH 4.0），负离子采用含10 mM碳酸氢铵与0.01%氨水的流动相（pH 8.5），提取溶剂为甲醇；血清与毛发以乙腈/水（3:1）复溶，尿液因盐含量高改用乙腈/甲醇（3:1）。该流程在不改变仪器采集参数的前提下，于血清、尿液和毛发中分别鉴定出118、196和166种代谢物，涵盖12个代谢物超类，其中65种为三基质共有，为大规模临床与转化研究提供了稳健、可转移的平台。
关键方法
研究人员主要采用四项关键方法：一是色谱条件系统优化，以合成氨基酸混合物（正离子模式）和有机酸混合物（负离子模式）为参照，通过热图（min-max归一化）比较不同流动相与进样溶剂组合下的峰形、选择性、信号强度、信噪比（S/N）与重现性；二是提取溶剂筛选与重现性评价，以8种覆盖不同化学类别的氘代内标（internal standards, IS）监测性能，按回收率、信号强度、变异系数（coefficient of variation, CV%）及注释代谢物数量筛选8种有机溶剂体系，并进行五次重复提取与提取温度（4 ℃与?20 ℃）比较；三是数据采集与处理，采用四极杆-飞行时间高分辨质谱（Triple TOF X500B）进行全扫描（m/z 35–900）与top-20数据依赖采集（data-dependent acquisition, DDA），经SCIEX OS软件对商用高分辨串联质谱库（AMMSL）检索并以自建库扩充，MS-DIAL进行峰对齐与归一，质量控制（QC）样本用于LOWESS归一化与批次漂移监测；四是方法学验证依托样本队列完成，队列为意大利米兰大学（University of Milan）法医毒理学实验室招募的24名健康男性（24–62岁，平均41±12岁），常规毒理筛查阴性，采集空腹血清、尿液与近端≤6 cm头皮毛发。
研究结果
3.1 色谱条件优化
3.1.1 正离子模式：以氨基酸混合物评价4种流动相与5种进样溶剂组合。流动相1、2整体信号较高，但脯氨酸峰形不佳，且亮氨酸/异亮氨酸这一对同分异构体未能充分分离；流动相4（A为乙腈/水9:1，B为水/乙腈9:1，均含10 mM甲酸铵和0.2%甲酸，pH 4.0）在分辨率、保留行为、信号稳定性与重现性间折中最佳，进样溶剂C（乙腈/水3:1）信号强度最高，故二者组合被选为正离子条件。
3.1.2 负离子模式：以有机酸混合物评价5种流动相。以乙酸铵（ammonium acetate）替换后多数分析物信号仍低，引入碳酸氢铵的条件4、5显著增强了信号强度与特征覆盖度，其中条件5（含10 mM碳酸氢铵和0.01%氨水，pH 8.5）综合性能最优，被选为负离子条件。
3.2 提取流程优化：8种氘代内标评价显示，甲醇（MeOH）在信号响应、回收率与精密度间平衡最佳，被选为提取溶剂；提取温度由4 ℃降至?20 ℃未显著改善回收率或重现性。三种基质内标回收率分别为血清76.84%、尿液25.00%、毛发66.85%，尿液因高盐与复杂基质导致回收偏低，但重现性最佳（平均CV% 5.69%，血清19.24%，毛发12.61%）；复溶溶剂经评价后，血清与毛发选乙腈/水（3:1），尿液因盐致相分离改用乙腈/甲醇（3:1）。
3.3 方法性能
3.3.1 代谢物鉴定：数据过滤后共鉴定出12个代谢物超类（包括生物碱、苯类化合物、碳水化合物、脂肪酸、有机酸、有机氮/氧化合物、有机杂环化合物、有机硫化合物、聚酮类、甾醇脂及核酸相关化合物）。尿液与毛发涵盖全部12类，血清未检出苯类化合物；各基质分别鉴定118、196、166种代谢物，尿液化学多样性最高（34个类别）、血清最低（21个类别），65种为三基质共有；各基质超类分布大体可比，表明流程无明显类别特异性检测偏倚。
3.3.2 血清与尿液代谢组：两基质共检测236种代谢物，仅78种（33.1%）同时为两者检出，118种（50.0%）仅见于尿液，40种（16.9%）仅见于血清，呈明显的基质互补分布；血清反映全身循环代谢，尿液富集肾滤过、排泄产物与微生物共代谢物，二者不宜相互替代。
3.4 研究局限性：正、负离子模式共用同一洗脱梯度，未针对每种缓冲添加剂单独优化梯度，故结果应理解为各添加剂在既定梯度下的性能；正离子仅评价甲酸铵/甲酸体系，未系统比较其他替代方案；流程主要针对极性代谢物优化，结论不宜外推至非极性代谢物或其他色谱柱与仪器平台。
讨论与结论部分总结
本研究开发并验证了面向血清、尿液和毛发的非靶向HILIC-HRMS极性代谢物分析流程。通过整合优化流动相组成、提取溶剂与进样条件，方法在不改变仪器采集参数的前提下实现了灵敏度、选择性与重现性的稳健平衡；两类缓冲流动相结合甲醇提取，实现了跨基质的广泛且均一的代谢组覆盖。研究同时强调，血清与尿液并非可互换基质，其部分重叠而基质特异性的代谢谱分别反映全身循环代谢与代谢物排泄，提供互补信息；商用光谱库与在同等LC-HRMS条件下实验获取标准品所建自建库的整合，提高了代谢物注释的可信度并扩展了覆盖范围。该流程为以极性化合物为焦点的大规模临床与转化代谢组学研究提供了可靠且可转移的平台。
结论部分翻译
本研究呈现了一种系统优化的HILIC-HRMS流程，用于人源血清、尿液和毛发中极性代谢物的非靶向分析。通过对流动相组成、提取溶剂与进样条件的整合优化，该方法在不改变仪器采集参数的条件下，实现了灵敏度、选择性与重现性之间的稳健平衡。缓冲的甲酸铵（ESI+）与碳酸氢铵（ESI?）流动相结合甲醇提取，使三种基质均获得广泛且均一的代谢组覆盖，每个基质均检测到12个代谢物超类及大量注释化合物。这些发现表明，血清和尿液不应被视为非靶向代谢组学中可互换的基质；其部分重叠而基质特异性的代谢谱分别反映全身代谢与代谢物排泄，具有互补价值。此外，商用光谱库与在同等LC-HRMS条件下实验获取标准品光谱所建自建库的整合，提高了代谢物注释的可信度并扩展了覆盖度，凸显了整合互补鉴定资源在非靶向代谢组学中的价值。所得流程可成为专注于极性化合物的大规模临床与转化代谢组学研究中可靠且可转移的平台。
