妊娠期SARS-CoV-2感染相关合体滋养层H3K4me3水平降低的表观遗传改变研究

《Archives of Gynecology and Obstetrics》：Epigenetic alterations in the placenta associated with SARS-CoV-2 infection during pregnancy

组蛋白修饰在染色质组织及转录调控潜能中发挥关键作用。既往研究在子痫前期患者的胎盘组织中观察到三甲基化组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4me₃）与乙酰化组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9ac）水平降低。基于上述发现，研究人员探讨了妊娠期或分娩时SARS-CoV-2感染是否与胎盘组蛋白修饰的改变相关。他们对来自60例患者的胎盘切片进行免疫组织化学染色（IHC）、探索性蛋白质免疫印迹（WB）分析及定性免疫荧光（IF）染色，患者被分层为四组：分娩时急性SARS-CoV-2感染组、妊娠期既往感染组、接种疫苗对照组以及未接种疫苗对照组。与未接种疫苗对照组相比，两组SARS-CoV-2暴露组合的合体滋养层（SCT）H3K4me₃水平均显著降低，其中妊娠期既往感染组的降低最为显著。经多重比较校正后，任何区室的H3K9ac水平在组间均无显著差异。SCT H3K4me₃水平与母亲年龄、孕龄或出生体重之间未发现显著关联，且排除合并其他胎盘病变病例的敏感性分析证实了研究结果的稳健性。由于未进行基因表达谱分析，无法推断所观察到H3K4me₃变化的基因转录后果。这些描述性发现提示，有必要进一步整合表观遗传学与转录组学方法，以阐明其对胎盘生物学和妊娠结局的功能学意义。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引发的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行对全球医疗体系，尤其是孕妇及其胎儿等脆弱群体构成了前所未有的挑战。尽管一般人群的临床表现和流行病学特征已得到广泛研究，但其对孕妇的影响仍需深入阐明。妊娠期是一种独特的免疫状态，以深刻的生理变化为特征，旨在容纳半同种异体胎儿，现有证据提示孕妇可能对SARS-CoV-2感染产生不同的免疫应答，更易出现严重结局。此外，病毒是否存在母体-胎儿垂直传播，以及母亲感染对胎盘健康和胎儿发育的潜在影响，仍是重要的未解问题。表观遗传机制，包括组蛋白修饰，在妊娠期间对基因表达和染色质结构的调控至关重要。既往研究表明，三甲基化组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4me₃）和乙酰化组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9ac）在子痫前期患者的胎盘组织中水平显著降低，提示表观遗传改变可能与该妊娠并发症的病理生理过程相关。鉴于子痫前期与COVID-19相关妊娠并发症在内皮功能障碍和炎症反应等方面存在病理生理重叠，研究人员假设SARS-CoV-2感染可能诱导胎盘组织产生类似的表观遗传改变，据此开展了本研究。

研究人员对60例孕妇的胎盘组织进行染色质免疫学分析，以探究妊娠期或分娩时SARS-CoV-2感染是否与胎盘H3K4me₃和H3K9ac水平变化相关。样本按感染及接种状态分为四组。研究得出，SARS-CoV-2暴露组（包括急性感染和既往感染）的合体滋养层（SCT）H3K4me₃免疫反应评分（IRS）较未接种疫苗对照组显著降低，且既往感染组降低最为明显；而H3K9ac水平在各组间差异无统计学意义。该发现为整合表观遗传学与转录组学的后续研究奠定了基础。

本研究主要技术方法包括免疫组织化学染色（IHC）、探索性蛋白质免疫印迹（WB）分析以及定性免疫荧光（IF）染色。研究队列来源于德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学（LMU）医院妇产科2017年8月至2022年7月期间收集的胎盘组织，最终纳入60例，分为四组：分娩时急性SARS-CoV-2感染组（n=15）、妊娠期既往感染组（n=16）、接种疫苗对照组（n=13）和未接种疫苗对照组（n=16）。染色评估采用半定量IRS，整合染色强度与阳性细胞比例；统计分析采用Kruskal-Wallis检验配合Dunn's事后检验及Bonferroni多重比较校正，并使用Spearman秩相关分析评估IRS与临床变量的关联。

研究结果：
描述性统计：四组患者在母亲年龄、出生体重及分娩孕周方面基本可比，急性感染组中有4例发生严重感染，2例需要插管；既往感染组大部分（75%）在妊娠34周前感染。
H3K4me₃与H3K9ac在SARS-CoV-2暴露胎盘中的蛋白质免疫印迹分析：鉴于样本量限制，未接种疫苗对照组、接种疫苗对照组和既往感染组各纳入3例，急性感染组纳入2例。结果显示，既往感染组β-actin标准化的H3K4me₃水平较未接种疫苗对照组呈降低趋势；H3K9ac则未见明确方向性模式。各指标样本间变异度大，仅作探索性展示。
COVID胎盘合体滋养层H3K4me₃降低：IHC分析显示，与未接种疫苗对照组相比，急性感染组（p=0.0308）和既往感染组（p=0.0002）SCT区H3K4me₃ IRS均显著降低，且既往感染组低于接种疫苗对照组（p=0.0029）。两组对照之间以及急性与既往感染组之间差异无统计学意义（p>0.999）。绒毛外滋养层（EVT）和蜕膜基质区均未发现显著组间差异。
SARS-CoV-2暴露胎盘中乙酰化组蛋白H3K9ac：在SCT区，各感染及接种组中H3K9ac IRS中位数数值上低于未接种疫苗对照组，但经多重比较校正后，任何区室的组间两两比较均无统计学显著差异（校正后p>0.999），EVT和蜕膜基质区亦无显著差异。
相关性分析：Spearman分析显示，母亲年龄与所有区室的IRS评分均无显著相关；分娩孕周与蜕膜基质及EVT的H3K4me₃ IRS、以及EVT的H3K9ac IRS呈弱正相关，提示更早产可能与蜕膜区组蛋白修饰水平较低相关；出生体重与EVT的H3K9ac IRS弱相关。SCT IRS与任何临床变量均无显著相关。探索性免疫荧光染色显示，急性感染与既往感染组的组蛋白修饰信号相对于细胞核（DAPI）染色比率均视觉上降低，与IHC结果方向一致。

讨论部分指出，本研究属于描述性、假设生成性分析，而非位点特异性或功能性表观遗传研究。主要发现是急性感染与既往感染组SCT的H3K4me₃ IRS较未接种疫苗对照组显著降低，且既往感染组降幅最大；H3K9ac则在经多重比较校正后未见显著改变。H3K4me₃通常富集于活跃转录基因的启动子区域，然而由于本研究未进行基因表达谱分析，无法将观察到的H3K4me₃差异解读为转录活性改变的证据。病毒可通过炎症信号和细胞应激反应影响表观遗传调控机制，但所观察到的SCT H3K4me₃改变的生物学意义仍不清楚，有待深入研究。

研究还指出，由于分析基于全组织切片，所观察值为跨细胞群的平均信号，可能低估细胞类型特异性效应。研究存在多项局限：未对血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PlGF）等功能相关基因的调控区进行位点特异性组蛋白分析，亦无基因表达数据；WB样本量极小（n=2-3），仅为探索性；无法排除接种疫苗对照组中存在无症状或未诊断的既往感染；少数合并子痫前期、前置胎盘或胎盘植入的病例分布于各组，可能构成混杂因素，但敏感性分析显示排除这三例后，SARS-CoV-2暴露组SCT H3K4me₃ IRS较未接种对照组降低的模式仍然维持且略有增强（未接种对照组 vs. 急性感染：p=0.0095；未接种对照组 vs. 既往感染：p=0.0002），H3K9ac仍无显著性；分娩孕周与蜕膜区室组蛋白修饰水平呈弱相关，鉴于急性感染组平均分娩孕周较低，孕周对蜕膜区室发现可能存在部分混杂作用。此外，既往感染的详细孕周及感染-分娩间隔时间无法在部分病例中获取。

最后，研究结论强调，这些观察结果不应被解读为反对疫苗接种的证据，因为接种疫苗的对照组未表现出病理性胎盘组蛋白修饰模式，且疫苗接种与活动性感染在免疫学上发挥根本不同的作用。综上所述，本描述性研究证实，妊娠期SARS-CoV-2感染与合体滋养层H3K4me₃水平显著降低相关，且该发现对排除额外胎盘病理病例具有稳健性；未来需更大队列并整合Bulk或空间转录组学方法，以明确这些表观遗传改变是否与胎盘基因表达变化及妊娠结局相关。