《Frontiers in Immunology》：HIF-1α expression in choroid plexus epithelial cells may be associated with structural enlargement in progressive multiple sclerosis: an exploratory study
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背景：既往研究已在转录组学（transcriptomics）层面报道了进展型多发性硬化（progressive multiple sclerosis，PMS）患者脉络丛（choroid plexus，ChP）中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducib
背景：既往研究已在转录组学（transcriptomics）层面报道了进展型多发性硬化（progressive multiple sclerosis，PMS）患者脉络丛（choroid plexus，ChP）中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）通路的激活。然而，HIF-1α蛋白在ChP组织中的表达尚未得到直接证实，其与ChP结构改变的关系仍不明确。因此，本研究旨在检测实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型中ChP上皮细胞的HIF-1α蛋白表达，以及PMS患者的ChP形态学改变。
材料与方法：研究人员重新分析了PMS患者（n=6）与正常对照（normal controls，NC；n=6）死后ChP组织的公共原始RNA-Seq数据（GEO: GSE137619），采用pyDESeq2鉴定显著上调基因，重点关注缺氧相关通路。在EAE小鼠（n=4）与NC（n=4）中进行了HIF-1α与水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP1）的免疫荧光共染色，以检测HIF-1α蛋白免疫反应性及其在ChP上皮细胞中的定位。在配对的HE染色切片上量化上皮细胞高度与基质厚度，并进行Iba1/CD68免疫荧光以评估阳性细胞聚集情况。此外，在一组独立的PMS患者（n=9）与健康对照（healthy controls，HC；n=30）中通过磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）评估ChP体积，以检测人PMS中的ChP结构改变。
结果：转录组重分析在PMS患者ChP中鉴定出15个显著上调基因（p<0.05），其中缺氧通路基因尤为突出，包括ADM、SERPINE1、STC2、SNHG15与HIF1A-AS3。与NC相比，EAE小鼠AQP1阳性ChP上皮细胞核内的HIF-1α免疫反应性显著增强（p=0.029，Mann-Whitney U检验）。EAE小鼠的注释ChP面积亦显著增大，且与HIF-1α表达在所有三项定量指标上均呈强相关（Spearman ρ=0.838–0.886，均p<0.01）。上皮细胞高度与基质厚度均增加，并伴有Iba1与CD68阳性细胞聚集增多。独立地，与HC相比，PMS患者归一化ChP体积显著增加（p=0.003，校正年龄与性别），与既往MS中ChP扩大的报道一致。
结论：本试点研究提供了补充性初步证据，表明在慢性神经炎症条件下ChP上皮细胞中HIF-1α免疫反应性升高，伴随上皮与基质结构改变以及Iba1与CD68阳性细胞聚集增多。
研究背景
多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是由免疫介导的中枢神经系统（central nervous system，CNS）慢性疾病，以脱髓鞘和灰质萎缩为病理特征；部分患者进展为进展型多发性硬化（progressive multiple sclerosis，PMS），全球受累人数至少130万。PMS患者多表现为持续的神经功能恶化，但其进展的致病机制尚未完全阐明，慢性神经炎症（chronic neuroinflammation）被视为疾病进展的重要驱动因素。脉络丛（choroid plexus，ChP）是调控CNS稳态的关键结构，主导脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）生成、免疫细胞迁移与神经营养因子分泌；MS患者脑脊液的独特分子特征及反复报道的ChP体积增大提示ChP是神经炎症的主动参与者和调节者，而非被动旁观者。既往转录组学研究已在PMS患者ChP中发现缺氧、神经保护与分泌功能相关基因上调，其中缺氧相关通路尤受关注，可能反映慢性神经炎症条件下ChP持续的代谢应激，但相关发现尚未在蛋白水平获得直接验证，且尚无动物模型能完整重现PMS。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）作为免疫介导性CNS炎症的经典模型，被广泛用于考察ChP在神经炎症条件下的反应。为此，研究人员整合三类互补证据——人死后ChP组织的转录组重分析、慢性期EAE模型的蛋白定位以及独立PMS患者队列的MRI结构评估——考察ChP上皮细胞HIF-1α表达、ChP结构改变及其相互关系，为缺氧相关ChP改变及其与结构重塑的关联提供补充性初步证据。
主要技术方法
研究人员主要采用四项关键技术方法：其一，采用pyDESeq2对GEO数据库公共数据集GSE137619（Rodríguez-Lorenzo等公布的PMS患者6例与正常对照6例死后ChP组织RNA-Seq数据）进行差异表达分析，以Benjamini–Hochberg法校正多重比较，阈值FDR<0.05；其二，构建以MOG
35–55免疫诱导的慢性期（免疫后12周）EAE小鼠模型，运用酪胺信号放大（tyramide signal amplification，TSA）多轮免疫荧光共染色检测HIF-1α与水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP1），并结合苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色形态计量学测量ChP面积、上皮细胞高度与基质厚度；其三，对Iba1与CD68进行免疫荧光定量，评估髓系细胞相关阳性细胞聚集；其四，在独立PMS队列（9例，含4例原发性进展型MS[primary progressive MS，PPMS]与5例继发性进展型MS[secondary progressive MS，SPMS]）和30例健康对照中行3T MRI扫描，采用全自动深度学习分割算法勾画ChP并归一化至估计总颅内体积。
研究结果
（1）PMS脉络丛的缺氧相关基因特征。重分析鉴定出15个显著上调基因（FDR<0.05），缺氧相关基因尤为突出，包括ADM、SERPINE1、STC2、SNHG15及HIF1A反义长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）HIF1A-AS3，并复现原始研究15个基因；而HIF1A mRNA本身无显著差异（log2FC=0.73，校正p=0.54），凸显蛋白水平验证的必要性。
（2）EAE小鼠ChP结构重塑。HE染色显示EAE小鼠ChP绒毛扩张、上皮肥大，注释ChP面积（0.0537 vs 0.0165 mm2）、上皮细胞高度（13.29 vs 9.01 μm）与基质厚度（31.85 vs 15.60 μm）均较NC显著增加（均p=0.029）。
（3）EAE脉络丛中HIF-1α免疫反应性增加。EAE小鼠AQP1阳性ChP上皮细胞核内出现HIF-1α聚集，NC则极少；HIF-1α阳性细胞计数、密度与阳性细胞比例均显著升高（均p=0.029），且ChP面积与三项定量指标强相关（Spearman ρ=0.838–0.886，均p<0.01）。
（4）Iba1与CD68阳性细胞聚集增加。Iba1与CD68阳性细胞计数、密度及比例在EAE小鼠中均显著升高（均p=0.029），提示髓系细胞相关聚集伴随ChP结构重塑。
（5）PMS队列的临床特征与ChP体积评估。PMS组与HC在年龄、性别上差异无统计学意义；校正年龄与性别后，PMS患者归一化ChP体积显著增大（p=0.003）；探索性部分相关分析未发现ChP体积与病灶体积、脑实质分数或病程存在显著关联。
讨论与结论
讨论部分强调，尸检转录组、慢性期EAE蛋白定位与独立MRI观察三类证据应互为补充，而非构成单一验证的因果链。HIF1A mRNA无显著差异符合HIF-1α依赖脯氨酰羟化酶介导蛋白酶体降解的翻译后调控规律，说明单纯转录组证据不足以确认HIF-1α通路激活，这直接推动了本研究的蛋白水平验证；本研究亦首次在非肿瘤性ChP上皮细胞中展示了HIF-1α的核免疫反应性定位。EAE中ChP面积与HIF-1α强相关提示结构扩大与缺氧信号为共现现象；Iba1与CD68升高仅提示髓系相关聚集，不能区分固有与浸润细胞，亦不能涵盖T、B淋巴细胞等适应性免疫细胞。PMS患者ChP体积增大与既往文献一致，凸显ChP结构改变与MS疾病负担的关联；因样本量小，阴性相关结果不能解释为无关。作者提出ChP增大可能涉及缺氧相关细胞肥大、间质水肿与结构重塑，但该推测系由慢性神经炎症小鼠模型外推，尚需人ChP组织直接验证。本研究为严格的探索性、假设生成性质研究，三类数据来自不同队列且无个体层面对应，无法开展跨模态关联分析；其他局限包括样本量小、EAE以外周炎症驱动为主难以模拟PMS区室化（compartmentalized）病理、PPMS与SPMS混合、形态测量依赖线性测量而非全区室分割或体学方法等。总体而言，研究为MS相关神经炎症提供了分子、组织学与影像层面的汇聚性互补证据。
结论（译文）：本试点研究表明，在神经炎症条件下，AQP1阳性ChP上皮细胞中HIF-1α免疫反应性增加，证实了人PMS脉络丛组织缺氧通路激活的转录组证据；在EAE模型中，HIF-1α表达与ChP结构扩大显著相关；独立观察到PMS患者ChP体积增加，与既往报道一致，提供了跨物种互补但无直接关联的结构证据。这些分子、组织学与影像水平的汇聚发现提示，缺氧信号与ChP结构重塑是MS相关神经炎症中共现的特征，值得在更大规模的前瞻性研究中进一步探索。
