《Virus Research》：Single-isolate resequencing expands the
Rhizoctonia solani IBRS16 virome and completes multiple viral genomes hidden in pooled analyses
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病毒组学研究因高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS）技术成本的降低而得到极大促进。然而，专注于病毒鉴定的研究通常在样本制备和数据分析中采用不同的方法。这些方法学差异取决于研究的具体目标和样本来源，并可能在对特定病毒群的检测
病毒组学研究因高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS）技术成本的降低而得到极大促进。然而，专注于病毒鉴定的研究通常在样本制备和数据分析中采用不同的方法。这些方法学差异取决于研究的具体目标和样本来源，并可能在对特定病毒群的检测中引入偏差或影响对低丰度病毒的灵敏度。对于感染真菌的病毒，最早基于HTS的研究主要使用双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）或单链RNA（single-stranded RNA, sRNA）测序对RNA样本中的病毒组分进行富集。这种偏好很大程度上归因于大多数真菌病毒是RNA病毒，仅有少数已知的环状单链DNA（circular single-stranded DNA, ssDNA）病毒作为例外。后来的研究将这些富集方法与核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）去除后的total RNA测序进行了比较，表明后者提高了检测灵敏度，特别是对于产生有限dsRNA复制中间体（replication intermediates）的病毒。此外，混合样本常被用于筛选真菌collection以简化和优化生物信息学分析并降低测序成本。这种方法确保每个分离株在混合池中得到平等代表，并根据混合到单个文库中的分离株数量调整测序深度。利用这一策略，研究人员分析了不同真菌的collection，无论是纯培养物还是与其自然宿主相关的样本。然而，目前尚无明确指南来标准化用于鉴定感染真菌collection的病毒的样本制备和处理流程，这给分析的可重复性带来了潜在问题。
立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）是一种担子菌（Basidiomycetes），因对多种重要经济作物具有致病潜力而得到深入研究。该真菌在病毒组方面也已被深入表征，表明其可以轻松携带多种病毒感染。2019年，研究人员报道了从日本结缕草（Zoysia japonica）上采集引起斑病的8个R. solani分离株的病毒组。由于鉴定的病毒数量众多以及混合HTS样本中存在多个低滴度病毒，当时许多鉴定出的病毒基因组不完整，且四个已证实病毒来源的contig无法 confidently 归属到任何已知病毒。后续研究提示了Picarelli等人鉴定的某些推定病毒片段与特定病毒群之间可能存在联系，特别是将一个解旋酶（helicase）编码contig和一个甲基转移酶（methyl transferase）编码contig分别与Hypoviridae科和Deltaflexiviridae科相关的病毒联系起来。鉴于这些初步结果，研究人员通过Illumina方法再次分析了R. solani IBRS16分离株，提高了测序深度，旨在完成原始研究中的部分病毒基因组。
利用新的测序数据，研究人员不仅能够重建七个先前已鉴定病毒的编码完整序列，还能够检测到十个新病毒，这些新病毒与Hypoviridae、Mycoalphaviridae、Deltaflexiviridae、Megabirnaviridae、Endornaviridae科以及Ambiviricota门相关。这些发现共同提供了对R. solani病毒组更全面的重建，并为具有高共感染率的真菌分离株进行RNA测序时相关的技术挑战提供了见解。
高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS）技术的普及极大推动了病毒组学发展，但不同研究在样本制备与数据分析上的方法差异可能引入检测偏差，尤其对低丰度病毒的灵敏度不足。真菌病毒研究早期多采用双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）或单链RNA（single-stranded RNA, sRNA）富集法，后续证实核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）去除后的total RNA（总RNA）测序能显著提高检测灵敏度。混合样本策略虽可降低真菌collection筛选成本并优化生物信息学分析，但缺乏标准化流程，且低丰度病毒在混合库中常因测序深度不足而难以完整组装，导致病毒基因组缺失或无法归属。立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）作为一种重要的担子菌（Basidiomycetes）植物病原真菌，其病毒组极为复杂，易于发生多重病毒感染。2019年，研究人员对采集自巴西并侵染日本结缕草（Zoysia japonica）的8个R. solani分离株进行了混合测序，鉴定出大量病毒，但由于低滴度病毒的存在，许多病毒基因组未能完整组装，且4个病毒contig无法 confidently 归属到已知分类群。后续研究提示这些未知contig可能与Hypoviridae（一类感染真菌的低相关病毒科）和Deltaflexiviridae（丁型flexivirus科）相关。因此，通过增加单个分离株的测序深度以完善不完整的病毒基因组，成为突破混合分析局限的关键。
针对上述问题，研究人员对原始研究中的同一R. solani IBRS16分离株（样本队列来源于巴西，寄主为日本结缕草）进行了单分离株重测序（single-isolate resequencing）。通过Illumina平台对rRNA去除后的total RNA进行测序，使目标分离株的测序深度较原混合文库增加约4.45倍。研究旨在利用提升的测序深度，完成此前在混合样本中未能完整组装或部分无法归属的病毒基因组，并系统挖掘该分离株中潜藏的病毒多样性。
研究成功重建了7个先前已鉴定病毒的编码完整序列，并新发现了10个病毒，分属于Hypoviridae、Mycoalphaviridae、Deltaflexiviridae、Megabirnaviridae（巨型双节段RNA病毒科）、Endornaviridae（内源RNA病毒科）科及Ambiviricota（双意病毒门）。这一发现不仅极大丰富了R. solani IBRS16的病毒组图谱，也揭示了高共感染真菌分离株在RNA测序中面临的技术挑战，证明了单分离株重测序在解析复杂病毒组方面具有不可替代的优势。
本研究样本队列为2019年混合研究中的R. solani IBRS16。关键技术方法包括：基于Illumina平台的单分离株重测序，结合rRNA去除的total RNA文库构建；对宏转录组（metatranscriptome）数据采用Trinity与SPAdes进行双软件de novo组装（de novo assembly）；利用BLASTx与Diamond进行病毒contig鉴定及ORFan（ORFan，指在现有数据库中无已知同源序列的开放阅读框）预测；通过ORFfinder进行开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）预测，结合CD-Search和Palmscan鉴定保守结构域；基于ICTV标准病毒序列构建多序列比对（Multiple Sequence Alignment, MSA）并进行最大似然法系统发育分析（Maximum Likelihood Phylogenetic Analysis）；运用RT-PCR、3'与5' RACE及Sanger测序验证病毒基因组末端完整性；此外，采用Infernal检测保守核酶，利用RNAfold预测核糖核酸（RNA）二级结构，并通过AlphaFold 3与Foldseek进行蛋白质结构比对分析。
在“HTS数据确认IBRS16分离株中此前鉴定的病毒”方面，通过单分离株重测序，成功验证了2019年混合研究中报道的30个病毒contig（对应25个病毒基因组及3个推定病毒ORFan）。Trinity与SPAdes组装比较显示，Trinity产生更多contig，而SPAdes在特定病毒的单一contig组装上更具优势。新组装共鉴定出10个新病毒contig。
在“大型hypovirus具有长基因间区且与5'端未翻译区（Untranslated Region, UTR）存在保守序列”方面，研究重建了RsHV3的完整基因组（21.6 kb），并证实RsHV1基因组因整合7,137 bp的ORFan片段而扩展至25,543 bp，成为迄今最大的hypovirus基因组。RsHV1含有三个ORF，其两个基因间区（intergenic regions）存在约700 nt的近似重复序列，经Sanger测序验证，且均含101 bp的茎环结构。ORF3编码的蛋白具有保守的依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）palm结构域（含'sdd' motif），系统发育分析将其归入Thetahypovirus属，并支持建立新属"Rhizochypovirus"。此外，RsHV1和RsHV22编码的超级家族I（Superfamily I, SFI）解旋酶与细菌及Nidovirales病毒相似，提示这些病毒可能通过水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）获取了相关基因。
在“在Mycoalphaviridae科内鉴定两个新病毒”方面，研究发现了两个正链RNA病毒RsAsV1和RsAsV2，系统发育分析将其归入Alphasclernavirus属，其基因组均编码包含解旋酶和RdRp结构域的多聚蛋白。
在“与Dumbiviridae科相关的新ambivirus”方面，新发现的RsAmV3为环状基因组（4,677 bp），含有两个反向ORF及两个反向锤头状核酶（hammerhead ribozymes）。基于ORFA氨基酸序列的系统发育分析表明，其虽接近Dumbiviridae（Dumbivirus科，一类环状RNA病毒），但可能代表Crytulivirales（一类病毒目）中的一个新科。
在“Rhizoctonia solani putative virus 3是deltaflexyvirus基因组的组成部分”方面，研究证实RsPuV3与RsFlV1实为同一病毒的不同片段，重建后的RsFlV1基因组为10,575 bp，属于Deltaflexiviridae科，其基因组包含解旋酶、RdRp及甲基转移酶（methyltransferase）结构域，支持对该科分类边界的重新评估。
在“与Megabirnaviridae科相关的新dsRNA病毒”方面，新病毒RsRMV1具有推测的单分体基因组（9,647 bp），系统发育分析显示其为Megabirnaviridae科的外群，建议为此类病毒建立新科"Rhizomonoviridae"。
在“Endornaviridae科的四个新病毒”方面，研究鉴定了RsEV17至RsEV20四种新endornavirus，基因组大小在15,834至20,416 bp之间，均含单一ORF编码多聚蛋白。其中RsEV18（20,416 bp）超过了ICTV通常报道的endornavirus基因组大小上限。系统发育分析将RsEV17和RsEV19归入Betaendornavirus属，RsEV18和RsEV20归入Alphaendornavirus属。
在“ORFan”方面，研究共鉴定出7个推定病毒ORFan，其中5个经PCR验证为病毒来源。ORFan3427被证实为RsAmV3的基因组区域。其余4个ORFan与已知病毒无序列关联，且结构预测未获得高置信度模型，也未发现RdRp同源物，其病毒属性仍需进一步验证。
讨论指出，真菌病毒组研究通常采用total RNA测序混合文库，但混合策略需要足够的测序深度以避免低丰度病毒的遗漏，且可能因近缘病毒共存而导致组装错误。本研究通过单分离株重测序，在单一真菌分离株中发现了极其丰富的病毒组，证明了提升测序深度对解析复杂病毒组的决定性作用。研究仍检测到病毒ORFans，提示可能存在更多低丰度病毒或未知病毒成分。组装软件比较显示，Trinity与SPAdes在完整病毒基因组重建上各具优势，二者互补使用更有利于复杂样本的分析。
研究特别指出，RsHV1不仅是最大的hypovirus，且其双解旋酶基因组组织可能在其系统发育分支中保守存在。与菌核（sclerotia）相关的细菌（如Pseudomonadota门和Firmicutes门）的密切关联可能促进了病毒与细菌或Nidovirales之间的水平基因转移（HGT）。RsHV1基因间区的重复序列可能参与亚基因组RNA（subgenomic RNA）合成及翻译调控，尽管具体功能尚不明确。此外，系统发育结果揭示了当前病毒分类框架的不足：Deltaflexiviridae可能需要增设新属；RsAmV3及其近缘序列可能构成Crytulivirales中的新科；具有单分体基因组的Megabirnaviridae-like病毒则支持建立"Rhizomonoviridae"新科。这些发现呼吁对现有分类系统进行全面修订。
研究结论认为，R. solani IBRS16的结果强化了R. solani作为病毒多样性和进化热点的观点，并为复杂病毒组的测序与生物信息学分析带来挑战。该物种的病毒组研究通常受益于高测序深度文库。这种动态病毒组可能由高效的传播机制维持：水平传播通过菌丝融合（anastomosis）在同融合群菌株间发生，垂直传播则通过担孢子在适宜条件下快速扩散；同时，部分病毒感染在真菌宿主中稳定维持。这些传播与维持机制共同促成了R. solani病毒组的高度丰富性。
