基于高通量定量PCR技术同步检测印尼西爪哇河水中的微生物源追踪标记、病原菌与抗生素抗性基因

《Science of The Total Environment》：Simultaneous quantification of microbial source tracking markers, pathogenic bacteria, and antibiotic resistance genes in river water using high-throughput quantitative polymerase chain reaction in West Java, Indonesia

本研究采用微流控高通量定量聚合酶链式反应（HT-qPCR）平台，对印度尼西亚西爪哇一条河流水样中的十种微生物源追踪（MST）标记物、五种病原菌、三种抗生素抗性基因（ARGs）、一种移动遗传元件（MGE）基因（Ⅰ类整合酶基因intI1）、一种粪便指示菌基因（大肠杆菌sfmD）以及总细菌16S rRNA基因进行了同步检测与分析。共采集了8个采样点的24份河水样品（旱季）。结果显示，人类相关的MST标记物人腺病毒（HAdV）和拟杆菌属人类源标记（BacHum）分别检出率为42%和50%，牛相关的MST标记物牛线粒体DNA（Bovine-mtDNA）检出率为46%。在检测的五种病原菌中，仅产气荚膜梭菌肠毒素基因（cpe）被检出（8%）。抗性基因中，磺胺类抗性基因sul1在所有样品中均被检出（100%），而超广谱β-内酰胺酶基因blaCTX-M和新德里金属-β-内酰胺酶基因blaNDM-1检出率分别为46%和50%。intI1检出率为96%。相关性分析显示，intI1、sul1和blaCTX-M之间存在强正相关关系（斯皮尔曼相关系数ρ = 0.77-0.85，p < 0.05），表明这些基因可能共同传播。空间分布上，ARGs和MST标记物在人口密集区域（采样点3至5）的丰度最高，尤其是在一处分散式污水处理设施（WWTF）下游的采样点5。研究表明，该研究河段受到了人和牛粪便废物的污染，并存在多种临床相关的抗生素抗性基因，特别是位于人口密集区下游的河段污染风险较高。HT-qPCR技术作为一种高效的多目标同步检测工具，为河流水质综合评估和精准管理提供了有力支撑。

研究背景与目的

作为发展中国家，印度尼西亚面临水资源分布不均和水与卫生基础设施不足的挑战。现有城市污水处理厂覆盖率低，大部分生活污水未经处理即排放，加上农业和畜牧业废弃物管理不善，导致地表水和饮用水持续面临高污染风险。该国常规水质监测侧重于理化指标，微生物评估仅限于粪大肠菌群和大肠杆菌计数，这种方法无法识别特定污染源，也难以捕捉更广泛的抗性组风险。微生物源追踪技术能够区分粪便污染的来源，而抗生素抗性基因和病原菌在水环境中的扩散对人类健康构成直接威胁。然而，使用传统方法同时评估这些潜在危险耗时费力。因此，本研究旨在利用微流控高通量定量聚合酶链式反应平台，同步分析河水中的MST标记物、病原菌、ARGs和MGE，以期阐明潜在的流行病学风险，并为地方当局提供可操作的、基于污染源的流域管理数据。

研究方法概述

研究人员在印度尼西亚西爪哇的一条河流中设置了八个采样点，覆盖上游（林地、畜牧场）、中游（高密度居民区和商业区）和下游（农田、草地）区域。于2023年8月底至9月初的旱季，分三次共采集了24份河水样品。样品经过离心浓缩后提取DNA/RNA，随后进行特异性靶标预扩增。最终，使用Biomark X9系统上的192.24动态阵列集成流路芯片进行HT-qPCR，该芯片允许在一次运行中针对24种不同的qPCR检测体系分析64个独立样品（三重复，共4608个反应室）。研究中分析的21个靶标包括：病毒性MST标记物（HAdV、BK多瘤病毒BKPyV、JC多瘤病毒JCPyV、crAssphage）、拟杆菌属MST标记物（BacHum、gyrB、BacR、Pig2Bac）、线粒体DNA MST标记物（Bovine-mtDNA、Swine-mtDNA）、病原菌（空肠弯曲杆菌ceuE、结肠弯曲杆菌gyrA、产气荚膜梭菌cpe、产志贺毒素大肠杆菌stx1和stx2）、ARGs（sul1、bla_NDM-1、bla_CTX-M）、MGE基因intI1、粪便指示菌基因（大肠杆菌sfmD）以及总细菌16S rRNA基因。

研究结果

3.1 HT-qPCR检测性能与质量控制

标准曲线性能参数显示，除crAssphage因扩增效率过高（146%）而被排除分析外，其余靶标的R2值介于0.989至1.000，扩增效率介于90%至113%，表明检测性能良好。通过与单重标准qPCR对比验证，对于Bovine-mtDNA、cpe和sfmD三个靶标，两种方法在定性检测上无显著差异（麦克尼马尔检验，p > 0.05），且在sfmD的定量结果上也相似。

3.2 各靶标在河流各采样点的检出情况与空间分布

在所有样品中，人类MST标记物HAdV和BacHum的检出率分别为42%和50%，牛MST标记物Bovine-mtDNA为46%。ARGs和MGE中，sul1和intI1的检出率极高，分别为100%和96%，而bla_CTX-M和bla_NDM-1的检出率均为46%-50%。五种病原菌中仅有cpe阳性的产气荚膜梭菌被检出（8%）。空间分布上，牛相关标记物主要在上游采样点1和2检出，而人类相关标记物则主要在中游人口密集的采样点3至5检出。sul1和intI1在所有采样点持续存在，其最高浓度出现在采样点5。两个β-内酰胺酶基因在上游采样点1和2未被检出，从采样点3开始间歇性出现，并在采样点5和8呈现较高检出频率。

3.3 ARGs相对于16S rRNA的相对丰度

在大多数样品中，intI1和sul1的相对丰度普遍高于β-内酰胺类抗性基因。其中，bla_NDM-1通常表现出最低的相对丰度，但在采样点8，其相对丰度超过了bla_CTX-M。

3.4 各靶标间的相关性矩阵

相关性分析显示，bla_CTX-M、sul1和intI1之间存在中等到强的正相关关系。bla_NDM-1仅与sul1呈显著中等相关。人类相关的细菌MST标记物BacHum和gyrB与多数ARGs（除bla_NDM-1外）呈显著正相关，其相关性强度高于反刍动物相关的MST标记物。粪便指示菌基因sfmD与BacHum、bla_CTX-M、sul1和intI1均显示出强正相关。

讨论与结论

讨论部分指出，HT-qPCR技术在技术上可行，但其结果需结合严格的质控（如逐孔检查扩增曲线）来解读。尽管样本量和采样周期有限，但研究成功展示了该技术在多目标同步检测方面的优势。研究发现，研究河段主要受到人类和牛粪便的污染。在检测的病原菌中，仅在人口密集区的采样点4和5检出了产气荚膜梭菌，暗示经处理的或部分处理的废水可能向受纳水体贡献了粪便相关微生物。环境抗性组分析揭示了与人为污染和MGE相关的结构，尤其是intI1、sul1和bla_CTX-M之间的强关联性，表明这些抗性决定因素可能共同传播。尽管bla_NDM-1广泛分布，但其丰度较低，表明碳青霉烯类抗性基因虽已扩散但尚未主导河流抗性组。采样点5（位于分散式WWTF下游）显示出更高的ARGs和微生物标记物丰度，提示局部污染源，特别是废水排放，应优先治理。此外，污染物可能在下游地区的地表水、灌溉网络、土壤和地下水系统中重新分布，因此有必要将监测和管理策略扩展到河水之外。

研究结论

综上所述，本研究加深了对河流中粪便污染、水源性病原体和抗生素耐药性传播的理解，从而更好地洞察了水质状况。尽管本研究样本量有限且仅代表单一季节的短暂时段，但研究结果凸显了通过HT-qPCR进行同步检测在未来促进战略监管和环境监测方面的潜力。研究发现，研究河段受到了人和牛的粪便废物以及关键的共存抗性基因的污染。特别是在采样点5观察到的ARGs和微生物标记物丰度升高，表明应优先缓解局部污染源，尤其是废水排放。此外，污染物潜在的下游迁移和再分布强调了有必要将监测和管理策略扩展到河水之外，涵盖灌溉网络和地下水系统。