Excessive COX-Prostaglandin Signaling Promotes Cellular Senescence and Impaired Skeletal Muscle Recovery in Aging：年龄相关COX-前列腺素信号持续激活介导细胞衰老与骨骼肌恢复障碍

《Aging Cell》：Excessive COX-Prostaglandin Signaling Promotes Cellular Senescence and Impaired Skeletal Muscle Recovery in Aging

　　

骨骼肌在废用（disuse）后恢复的能力随年龄增长而下降，导致力量与功能出现持续性缺陷，且这些缺陷超出肌质量丢失的范围。本研究探讨了年龄相关的脂质重塑（lipid remodeling）改变是否参与废用后骨骼肌恢复受损。脂质组学（lipidomics）与氧化脂质（oxylipin）谱分析显示，老年小鼠骨骼肌在废用性肌萎缩（disuse atrophy）早期恢复阶段以持续性磷脂酰胆碱（PC）与omega-6依赖的COX-前列腺素信号为特征。这一持续的脂质介质反应与衰老负荷（senescence burden）增加、纤维化及功能恢复受损相关。在老年小鼠再负荷（reloading）期间药理学抑制COX信号，可降低衰老标志物、限制纤维化并改善肌肉功能，且该改善独立于肌尺寸的增加。机制上，衰老诱导的巨噬细胞产生COX-2依赖的PGE2，并通过旁分泌信号（paracrine signaling）损害肌管（myotube）尺寸与融合。激活EP2信号足以诱导衰老巨噬细胞表型。重要的是，在老年人肢体固定（limb immobilization）后也观察到类似的年龄相关氧化脂质含量失调，支持了这些发现的转化相关性。综上，研究结果确定持续性COX-前列腺素信号是衰老过程中骨骼肌恢复受损的关键特征，并提示靶向调控该通路可能改善老年人的肌肉恢复。临床试验注册号：ClinicalTrials.gov NCT04416191。

1 Introduction

骨骼肌废用（disuse）可由损伤、住院或手术引起，导致肌质量与力量迅速下降。年轻人通常可在这些应激后恢复骨骼肌质量与功能，而老年人恢复能力较差，常出现不完全恢复，进而导致持续性肌无力、活动能力下降及残疾风险升高。值得注意的是，衰老相关的功能损害并不能完全归因于肌质量丢失，提示适应不良性组织重塑与细胞组成改变（如纤维化）也参与恢复受损。然而，这种年龄相关恢复障碍的分子机制尚不清楚。骨骼肌恢复涉及膜磷脂（membrane phospholipids）的动态重塑，膜磷脂既是结构成分，也是生物活性脂质底物的储库。磷脂酰胆碱（PC）是最丰富的膜磷脂之一，含酯化多不饱和脂肪酸（PUFAs），包括花生四烯酸（AA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）。在细胞应激与组织重塑过程中，磷脂酶（尤其是胞质磷脂酶A₂，cPLA2）激活释放这些脂肪酸，进而经酶促或非酶促途径转化为氧化脂质（oxylipins），后者是调节炎症、免疫细胞募集、细胞外基质重塑与组织修复的多样生物活性脂质介质。衰老与骨骼肌中氧化脂质谱改变及AA、EPA、DHA来源脂质介质蓄积相关，但再负荷期间膜脂重塑是否随年龄被破坏并导致恢复受损仍不清楚。氧化脂质经环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LOX）、细胞色素P450（CYP）及非酶促氧化途径生成；其中COX通路生成PGE₂、PGF₂α等前列腺素，在骨骼肌再生、炎症与纤维化中作用明确。短暂的前列腺素信号支持急性损伤修复，但 prolonged 或过度激活可能促进适应不良性重塑。衰老与脂肪酸组成改变及多种组织中omega-6来源脂质介质水平升高相关；与此一致，衰老人类骨骼肌PGE₂生成能力增加，提示COX-前列腺素活性增强可能参与肌肉恢复受损。同时，衰老骨骼肌蓄积衰老细胞，其衰老相关分泌表型（SASP）以促炎与促纤维化信号为特征；衰老与老年骨骼肌恢复不良、纤维化及功能下降相关。脂质来源介质可影响与衰老相关的应激反应与炎症信号通路，但氧化脂质与衰老负荷在衰老肌肉恢复中的联系仍待确定。本研究假设衰老改变肌肉恢复期间膜磷脂含量，导致omega-6来源及COX相关氧化脂质池优先扩增，进而促进衰老负荷并损害功能恢复。为验证该假设，研究对经后肢卸载与再负荷的年轻与老年小鼠骨骼肌进行整合脂质组学与靶向氧化脂质谱分析，探究脂质介质重塑与衰老负荷及肌肉恢复的相关性，评估再负荷期间药理学抑制COX通路的功能影响，并研究下游前列腺素信号的作用；最后评估小鼠中观察到的年龄相关氧化脂质重塑模式是否在老年人肢体固定与恢复后重现。

2 Materials and Methods

2.1 Human Study：年轻（n=5；3男2女，23±3岁，SD）与健康老年人（n=6；4男2女，68±4岁，SD）来自盐湖城地区，为近期发表的一项更大规模研究的一部分。研究访问在犹他大学临床与转化科学研究所进行，所有程序经犹他大学机构审查委员会批准（IRB #130232），遵循《赫尔辛基宣言》，并获得书面知情同意。参与者完成14天单侧肢体固定，随后恢复2天与7天（RL2、RL7）。固定期间佩戴固定于60°屈曲位的膝关节支具，并使用拐杖或助行器保持非负重。在固定前（PRE）、固定后（POST）及恢复2天和7天（RL2、RL7）过夜空腹后行股外侧肌骨骼肌活检。组织样本（约50 mg）速冻于液氮并保存于?80°C用于后续脂质组学分析。

2.2 Animals：所有动物程序经IACUC批准并按既定指南执行（方案1476至M.J.D.）。小鼠饲养于犹他大学动物资源中心（AAALAC认证、NIH批准设施）。年轻（约4月龄）与老年（约25月龄）雄性C57BL/6小鼠购自美国国家衰老研究所（NIA）。小鼠在标准条件下饲养，12小时明/暗周期，自由饮水与标准饲料（Envigo 2920X）。小鼠中雄性肌肉衰老常更明显，使其成为研究人类肌肉衰老相关方面的合适模型；本研究未纳入雌性，但 underlying 生物学过程可能两性共享，未来仍需研究。动物按相近初始体重分组，每日检查总体健康与体重变化。出现疾病征象、明显体重丢失、与研究无关的活动问题或肿瘤负荷的小鼠被剔除（约5–8只）。

2.3 Hindlimb Unloading and Reloading：年轻与老年小鼠分为：自由活动对照（AMB）、14天后肢卸载（HU）、或HU后恢复2、4、7天（RL2、RL4、RL7）。对照（AMB）小鼠留在标准笼中（每笼2–4只），不进行卸载。后肢悬吊采用改良Morey-Holton法，14天卸载期间每笼2只。再负荷组小鼠在HU后返回标准笼自由活动。研究终点时小鼠禁食3小时，异氟烷麻醉后颈椎脱位处死。采集后肢肌肉（腓肠肌与比目鱼肌），称重，并制备、液氮速冻或使用预冷异戊烷包埋于OCT中保存于?80°C。

2.4 COX-Inhibitor Treatment：HU后，老年小鼠随机分为三组：（1）低剂量COX抑制剂（30 mg/kg/天）、（2）高剂量COX抑制剂（60 mg/kg/天）、（3）溶剂对照（5% DMSO生理盐水）。COX抑制剂布洛芬（Ibuprofen，Thermo Scientific #AC258610100）溶于DMSO与生理盐水，无菌技术腹腔注射。所有小鼠每日注射两次（约上午8:00与下午5:00），连续两天，对应再负荷第0天（HU后即刻）与第1天。每次注射给予每日总剂量的一半（低剂量组每次15 mg/kg，高剂量组每次30 mg/kg）。

2.5 Lipid Peroxidation (MDA) Assay：使用脂质过氧化检测试剂盒（Abcam，ab118970）按厂商方案测定腓肠肌丙二醛（MDA）水平，分光光度计532 nm测定MDA-TBA加合物吸光度。

2.6 Cell Culture and Immortalize Cell Line：小鼠C2C12（CRL-1772，ATCC）、NOR-10成纤维细胞（CCL-197，ATCC）与RAW 264.7巨噬细胞（TIB-71，ATCC）培养于DMEM 4.5 g/dL、10% FBS、1%青霉素–链霉素；肌管分化使用DMEM 4.5 g/dL、2% HS、1%青霉素–链霉素，均接种于6孔板。多柔比星诱导衰老方案：细胞以多柔比星（DOX，0.1 μM；Cayman，15007）或溶剂处理24小时，随后洗涤并在新鲜培养基中维持3天，不加实验处理。细胞行SA-β-Gal染色，收集分泌液行PGE₂ ELISA（Cayman Item No. 500141）。RAW 264.7巨噬细胞处理策略：以DOX（0.1 μM）、DOX+NS-398（20 μM；Cayman，70590）、EP2激动剂butaprost（1 μM；Cayman，13740）或溶剂处理24小时，随后洗涤并在新鲜培养基中维持3天。使用商业试剂盒（Cell Signaling Technology，#9860）按厂商指南行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性染色：1×PBS洗涤，室温固定15分钟，1×PBS冲洗两次，加入pH 6.0、含1 mg/mL X-gal的β-半乳糖苷酶染色液，封口膜密封，37°C无CO₂孵育过夜；去除染色液后加80%甘油成像。使用倒置Olympus IX71显微镜采集图像；每个重复随机拍摄每孔三个不重叠视野，测量值平均为单个生物学重复值。以阳性蓝色染色鉴定衰老细胞，计算SA-β-Gal阳性细胞占每视野总细胞的百分比。三重染色DAPI/p53/COX-2：RAW 264.7以4%多聚甲醛（PFA）室温固定15分钟，0.3% Triton X-100透化，Fc受体阻断（anti-CD16/32，克隆2.4G2，BioLegend）；为减少鼠源一抗背景，样本先以Mouse-on-Mouse（M.O.M. MKB-2212-1，Vector Laboratories）封闭试剂处理；4°C过夜孵育鼠抗p53（1:1000，CST 1C12），继以Alexa Fluor 647偶联抗鼠F(ab′)?二抗（1:500，CST #4410）；再次封闭后4°C过夜孵育兔抗COX-2（1:500，CST D5H5），继以Alexa Fluor 488偶联抗兔F(ab′)?二抗（1:500，CST #4412）；DAPI（1:10,000）复染核，PBS保存成像，步骤间以1×PBS洗涤。使用EVOS FL成像系统（Invitrogen）20×物镜采集图像。条件培养基（CM）生成：上述24小时处理后3天孵育期间培养基调整为2% FBS以限制对肌管的影响并仅捕获处理效应；为维持分化条件，所有CM在处理前补充2%马血清（HS）。完全分化肌管暴露于各组100% CM 24小时。6孔板中分化的C2C12肌管以冰冷4% PFA室温固定15分钟，1×PBS洗三次，0.1% Triton X-100/PBS室温透化15分钟；洗涤后以2.5%牛血清白蛋白（BSA）/1×PBS室温封闭1小时，4°C过夜孵育抗肌球蛋白重链一抗（MF20，DHSB，封闭液1:100）；洗涤后室温孵育Alexa Fluor 488二抗（1:250；Invitrogen）1小时，DAPI（5 μM）复染核10分钟，洗涤后PBS保存成像。使用EVOS FL成像系统10×物镜采集图像；每个重复随机选择每孔三个不重叠视野成像。使用MyoCount软件（v1.3.1，经MATLAB Runtime v9.4，R2018a，MathWorks）分析。肌管面积以肌球蛋白重链阳性肌管占图像面积百分比计算；同时定量总核数与融合指数，融合指数定义为位于肌管内的核占总核比例；含至少三个核的肌管视为功能性。多视野测量值平均为单个生物学重复值。

2.7 Grip Strength：在多个时间点（AMB、HU、RL4、RL7）使用握力计（Columbus Instruments）评估握力。小鼠先在金属网格上适应30秒，随后连续三次抓握试验（无休息），轻拉尾根部，记录每次峰值力，三次平均代表总体握力。为保持一致性，所有时间点均在一天中相同时间测试，且每次牵拉前要求四肢均在网格上。

2.8 Ex-Vivo Skeletal Muscle Force Production：麻醉小鼠取比目鱼肌评估收缩特性。肌肉分离并两端结扎固定于水平体外浴系统（Aurora Scientific，Model 400A），浴槽充氧Krebs-Ringer液补充8 mM葡萄糖。单收缩（20 V，0.2 ms脉宽）确定最佳产力长度，平衡后行递增频率强直刺激（10–200 Hz，20 V，0.2 ms脉宽）。力实时记录于Aurora Scientific Dynamic Muscle Control软件（DMC v5.500），并以Dynamic Muscle Analysis软件（DMA v5.321）分析。比力（mN/mm²）通过基于肌长与湿重估算的肌肉横截面积计算。

2.9 Immunofluorescence and Histology：腓肠肌与比目鱼肌包埋于OCT，液氮预冷2-甲基丁烷速冻，Leica CM1860冰冻切片机10 μm切片。染色后使用Zeiss Axio Scan.Z1玻片扫描仪20×物镜成像。SA-β-Gal染色联合苏木精-伊红（H&E）复染按先前描述进行：肌肉切片25%戊二醛固定10分钟，37°C X-gal染色液（pH 6.0）孵育，复染、脱水、Cytoseal封片；SA-β-Gal⁺细胞用Fiji定量并以QuPath按切片面积归一化。卫星细胞（PAX7⁺）：切片4% PFA固定，柠檬酸钠缓冲液92°C抗原修复；3%过氧化氢封闭后以Mouse-on-Mouse IgG封闭试剂（Vector）处理1小时；4°C过夜孵育抗Pax7一抗（1:100，DSHB）；次日孵育生物素化山羊抗鼠二抗（Jackson ImmunoResearch），继以Tyramide SuperBoost试剂盒Alexa Fluor 488（Invitrogen）；DAPI与小麦胚芽凝集素（WGA-647，Invitrogen）行核与膜染色；Vectashield封片4°C保存。卫星细胞鉴定为PAX7⁺/DAPI⁺细胞。γH2AX⁺细胞按厂商方案（Cell Signaling）免疫荧光显色：4% PFA固定，PBS洗涤，5%山羊血清+0.3% Triton X-100/PBS封闭1小时；4°C过夜孵育抗γH2AX（1:400，Cell Signaling #2577S）；PBS洗涤后Alexa Fluor 647偶联山羊抗兔二抗（1:1000，Invitrogen）90分钟；DAPI与WGA-488行核与膜染色；γH2AX⁺/DAPI⁺细胞用QuPath定量。p21⁺染色：4% PFA固定，PBS洗涤，3%过氧化氢封闭10分钟，2% BSA+0.1% Triton X-100封闭1小时；4°C过夜孵育抗p21一抗（1:200，Abcam ab109199）；次日孵育生物素化抗兔二抗（1:1000，Jackson ImmunoResearch），继以链霉亲和素-HRP 60分钟与Alexa Fluor 555（1:200，Invitrogen）15分钟；PBS洗涤后DAPI与WGA-488复染；Vectashield封片4°C保存；p21⁺细胞用QuPath定量。胶原含量以天狼星红（Sirius Red）染色评估：切片Bouin液（Sigma-Aldrich）56°C固定1小时，室温Sirius Red染液（Abcam ab246832）染色1小时，0.5%乙酸与水洗三次去多余染料，乙醇脱水、二甲苯透明、Cytoseal XYL（Fisher Scientific）封片；FIJI/ImageJ对感兴趣区颜色阈值化定量Sirius Red染色面积。横截面积、中央核纤维频率与卫星细胞含量使用FIJI/ImageJ中MuscleJ v1.0.2插件高通量自动分析定量。衰老标志物定量使用QuPath；所有成像与测量均对实验分组盲法完成。

2.10 Real-Time PCR：使用QIAzol（Qiagen，#79306）从腓肠肌（约20 mg）提取RNA，按厂商说明以氯仿与异丙醇分离沉淀，无核酸酶水重悬并定量（Take3，BioTek）。1 μg RNA经iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，#17088-91）与Bio-Rad T100热循环仪逆转录（20 μL体系：25°C 5分钟，46°C 20分钟，95°C 1分钟，4°C）。实时定量PCR使用1:8稀释cDNA，在CFX Connect Real-Time PCR检测系统（Bio-Rad）上以SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，#17252-70）进行。表达水平以核糖体蛋白L32为参照校正；与对照（生理盐水组）的倍数变化用2^?ΔΔCt法计算。选择代表衰老与COX-2相关标志物的基因表达读数；引物序列购自犹他大学健康科学中心核心实验室，包括L32、P53、p21、p16INKA、PAI-1、Igfbp4、Il-1b、Il-6、IFNγ、TNFα、Ccl2、Ccl8、Cxcl10、Timp2、Col3a1、Ptges-1与Ptger1。

2.11 Oxylipins Profiling：人股四头肌与小鼠腓肠肌速冻骨骼肌（约20 mg）在加州大学圣地亚哥脂质组学核心进行靶向氧化脂质定量，遵循既定核心方案（固相萃取、液相色谱与串联质谱），以稳定同位素稀释法定量并按组织湿重归一化（pmol/mg组织）。骨骼肌组织（约20 mg）在含10%甲醇的磷酸盐缓冲液中匀浆并加入氘代氧化脂质内标；脂质经Strata-X柱（Phenomenex）固相萃取分离，氧化脂质以甲醇洗脱、真空干燥、在含乙腈与乙酸的水相缓冲液中复溶。反相超高效液相色谱（UPLC）使用RP C18 BEH Shield柱（2.1×100 mm；1.7 μm；Waters）；数据采集于AB SCIEX 6500 QTrap质谱仪（IonDrive Turbo V源），负电喷雾电离模式；每种氧化脂质监测多反应监测（MRM）跃迁，通过与真实标准品保留时间及MRM特征匹配确认身份；通过内标峰面积比与相同条件下制备的校准曲线比较实现绝对定量；数据以pmol/mg组织湿重报告。

2.12 Mass Spectrometry：所有脂质组学实验由犹他大学代谢组学核心完成。冻存腓肠肌组织使用内标（Avanti Polar Lipids）按改良甲基叔丁基醚（MTBE）提取方案提取脂质。组织称重并在甲醇/PBS/内标混合物中匀浆；加MTBE，冰上孵育1小时并间歇涡旋；4°C 15,000×g离心10分钟，收集有机相并以SpeedVac干燥；脂质丰度按组织重量（mg）归一化。脂质提取物使用Acquity UPLC CSH C18柱与VanGuard预柱（65°C）分析；色谱分离在Agilent 1290 UPLC系统上耦合6545 Q-TOF质谱仪，正或负电离模式；样本随机化，扫描m/z 100–1700。流动相A为ACN:H₂O（60:40，v/v）含10 mM甲酸铵与0.1%甲酸，流动相B为IPA:ACN:H₂O（90:9:1，v/v/v）含相同修饰剂；流速0.4 mL/min，正模式进样2 μL、负模式10 μL。串联MS采用迭代排除，正负模式碰撞能量分别为20 V与27.5 V。数据使用Agilent MassHunter Workstation（定性定量模块）处理；全程纳入质控（QC）样本（n=8）与过程空白（n=4）评估重复性与污染。脂质鉴定基于精确质量与MS/MS谱匹配，使用Agilent Lipid Annotator库与LipidMatch；两种电离模式数据按脂质类别合并。特征在Excel中过滤，仅保留QC样本相对标准偏差（RSD）<30%且空白背景信号<QC信号30%者；最终脂质强度按类别特异性内标、组织重量与总脂质丰度归一化后行统计分析。

2.13 Western Blot：约30 mg腓肠肌组织在裂解液（50 mM Tris–HCl pH 7.5，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1% Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，1×蛋白酶与磷酸酶抑制剂，ThermoFisher）中匀浆；离心收集上清，BCA法（Thermo Scientific）测蛋白浓度。等量蛋白经4%–20%凝胶分离并转至硝酸纤维素膜；室温2.5%脱脂奶粉/TBST封闭1小时，4°C过夜孵育一抗（1:1000，2.5%奶粉-TBST稀释）；次日室温孵育二抗（1:4000，2.5%奶粉）1小时；ECL Prime化学发光试剂（GE Healthcare，cat #RPN2236）检测，ChemiDoc XRS系统（Bio-Rad）成像，Image Lab软件（Bio-Rad）定量条带强度。使用Abcam总OXPHOS Rodent一抗（#ab110413）。

3 Results

3.1 Aging Impairs Skeletal Muscle Recovery and Alters Membrane Lipid Remodeling Following Disuse：年轻与老年小鼠行14天后肢卸载后分别再负荷2、4、7天。后肢卸载使两组全身握力下降，但老年小鼠再负荷7天后未能完全恢复至基线。腓肠肌质量在卸载后下降，老年小鼠未能完全恢复，而年轻小鼠再负荷期间恢复至接近基线；比目鱼肌与跖肌呈相似趋势，而胫骨前肌（TA）与趾长伸肌（EDL）相对不受影响。RL7时，年轻小鼠较大的腓肠肌质量与更强握力正相关，老年小鼠则两项指标均持续受损。对腓肠肌行非靶向脂质组学分析显示，基线时已存在部分年龄相关聚类，废用后尤其再负荷期间聚类分离更明显。相对脂质类别丰度显示，磷脂酰乙醇胺（PE）与甘油三酯（TAG）为主要类别，而PC呈明显年龄依赖重分布；老年肌肉多种磷脂显著增加。再负荷期间LPC自RL2至RL7逐渐升高，而老年肌肉PC在所有时间点保持高位；与既往骨骼肌损伤模型中LPC升高伴PC耗竭不同，本研究显示PC水平在LPC生成增加时仍升高，提示磷脂周转增强而非膜丢失。多数膜PC含AA及DHA、EPA；游离AA在再负荷时呈明显年龄依赖升高并持续，而年轻肌肉各时间点保持较低水平；omega-3底物变化有限，游离DHA主要在再负荷阶段差异，游离EPA与肾上腺酸基本稳定。相关分析显示RL7时腓肠肌质量与多种膜脂类别（PC、LPC、心磷脂CL）显著负相关。线粒体OXPHOS蛋白与脂质过氧化在恢复期间年龄差异有限，仅年轻腓肠肌基线复合体V富集及老年腓肠肌HU相关MDA升高。上述结果提示膜磷脂重塑及cPLA2介导的PUFA释放与蓄积与衰老废用后骨骼肌恢复受损密切相关。

3.2 Aging Disrupts Oxylipin Pathway Remodeling During Skeletal Muscle Recovery：靶向LC–MS/MS氧化脂质谱显示年龄与时间相关变化，再负荷阶段尤其RL7更明显。omega-3来源介质年龄差异主要在RL2与RL4，RL7无持续升高；omega-6来源氧化脂质在老年肌肉起效更早、升高更持久，RL2与RL4显著高于年轻肌肉并持续至RL7，且老年组RL7较自身基线显著升高，年轻组无显著变化。总氧化脂质丰度在老年肌肉自RL2起显著增加，RL7较自身基线显著升高，年轻肌肉相对稳定。通路特异性分析显示COX相关氧化脂质在RL2与RL4存在显著年龄差异，老年组RL4与RL7较基线显著升高，年轻组无显著升高；非酶促氧化脂质池轨迹相似但不持续；COX相关氧化脂质绝对浓度显著高于非酶促产物，提示COX来源介质是年龄相关氧化脂质扩增的主要贡献者。LOX通路中，5-LOX仅在HU时呈年龄效应（年轻较高），15-LOX仅在基线差异，12-LOX在RL4呈选择性年龄依赖升高但RL7未维持；CYP来源氧化脂质无显著差异。单个前列腺素分析显示老年肌肉再负荷期间PGE₂、dhk PGE₂、PGF₂α、PGD₂、11b PGF₂α与TxB2显著高于年轻肌肉，年轻肌肉水平相对稳定。热图显示老年肌肉多种氧化脂质相对升高，年轻肌肉以短暂波动为主。为确定这些模式是否在人类中保守，研究检测单侧腿固定与恢复后股四头肌氧化脂质重塑：年轻与健康老年男性行2周单腿固定后恢复7天，于固定前（Pre）、固定后（Post）、恢复2天与7天（RL2、RL7）活检。与老年小鼠显著重塑不同，人类骨骼肌恢复期间酶促通路来源总氧化脂质无显著变化；但单个COX来源前列腺素分析显示，老年人RL7时PGE₂与PGF₂α显著高于年轻人，dhk PGE₂接近统计学显著，PGD₂与TxB2呈上升趋势，11b PGF₂α在人骨骼肌未检出。单个氧化脂质分析显示年轻肌肉早期短暂升高并在RL7部分消退，老年肌肉RL7呈更广泛持续蓄积。上述结果表明老年人骨骼肌恢复伴随放大的氧化脂质重塑，重现老年小鼠的脂质介质蓄积；尽管临床前模型反应更早、幅度更高，两项数据集均汇聚于omega-6来源与COX相关前列腺素通路的优先扩增。

3.3 COX-Prostaglandin Signaling Links Senescence Burden and Impaired Muscle Recovery in Aged Mice：为确定再负荷期间脂质介质重塑改变是否与细胞衰老及功能恢复相关，研究检测年轻与老年骨骼肌衰老与SASP负荷及其与COX来源氧化脂质的关系。腓肠肌SA-β-Gal阳性细胞定量显示，老年小鼠RL4显著蓄积衰老阳性细胞并于RL7进一步增加，年轻肌肉各时间点不变；组内比较证实年轻小鼠衰老细胞水平不变，老年小鼠自基线至RL7进行性增加。RL7相关分析显示年轻小鼠SA-β-Gal⁺细胞与肌质量无关系，老年小鼠呈显著负相关，衰老负荷越高腓肠肌质量越低。衰老标志物与SASP转录分析显示时间和年龄依赖变化，晚期再负荷（RL7）最明显：老年腓肠肌p53与p16表达显著高于年轻，p21在各年龄与时间点无变化；老年组p53自基线至RL7显著升高。SASP相关基因中，PAI-1、IFN-γ、Igfbp4与IL-6在老年肌肉RL7优先升高，其中PAI-1、IFN-γ与IL-6在老年组自基线至RL7显著升高；IL-1β各年龄与时间点无变化。相关分析显示RL4与RL7时腓肠肌质量与总COX相关氧化脂质及主要下游前列腺素PGE₂、PGF₂α负相关，与TxB2关联未达显著。对其他酶促与非酶促脂质途径的分析显示，RL4时非酶促氧化产物、5-LOX、15-LOX与CYP来源代谢物与腓肠肌质量显著负相关，主要由老年组驱动，12-LOX呈相似趋势，但RL7时这些相关性不再明显；提示老年肌肉早期再负荷存在更广泛脂质重塑，但脂质介质活性与恢复受损的持续关系在COX通路最一致。COX通路活性及下游前列腺素与RL4时SA-β-Gal⁺细胞蓄积正相关。其他通路中仅12-LOX活性与RL4时SA-β-Gal⁺细胞丰度显著正相关，5-LOX、15-LOX、CYP与非酶促产物无此相关。此外，编码微粒体前列腺素E合酶-1（mPGES-1）的Ptges-1表达在再负荷期间升高，mPGES-1将COX来源PGH₂转化为PGE₂；编码介导下游PGE2信号的EP1 G蛋白偶联受体（GPCR）的Ptger1表达亦升高，提示PGE₂合成–信号轴激活。RL7时Ptges-1表达与衰老标志物及SASP相关转录正相关。上述数据将过度omega-6驱动的COX-前列腺素重塑与衰老负荷及衰老废用后骨骼肌恢复受损相联系。

3.4 Pharmacological Inhibition of COX-Prostaglandin Signaling Improves Functional Recovery and Reduces Senescence Burden in Aged Muscle：为检验COX-前列腺素信号增强是否参与老年肌肉恢复受损，研究对老年（约25月龄）小鼠行后肢卸载后7天再负荷，并在再负荷期间腹腔给予COX抑制剂（生理盐水、低剂量或高剂量）。首先确认药物抑制靶点：COX抑制剂处理小鼠腓肠肌Ptges-1与Ptger1表达较生理盐水对照显著降低；低剂量显著降低两个转录本，高剂量降低Ptger1并呈降低Ptges-1趋势，证实PGE₂合成–信号轴有效抑制。低剂量处理小鼠全身握力（按体重归一化）显著高于生理盐水对照，高剂量未改变握力；腓肠肌与比目鱼肌质量组间无显著差异，提示COX抑制并非通过增加肌质量改善功能恢复。尽管肌质量不变，低剂量组收缩能力改善：比目鱼肌各刺激频率比力显著高于对照，中高频差异显著，绝对力亦改善；高剂量与生理盐水组比力与绝对力均无显著差异。腓肠肌平均肌纤维横截面积组间无显著差异，但纤维尺寸分布分析显示特定尺寸区间存在轻度差异；中央核纤维比例与Pax7⁺卫星细胞组间相似。天狼星红染色显示低剂量COX抑制剂显著降低腓肠肌纤维化胶原含量，高剂量无显著影响。再负荷期间抑制COX-前列腺素信号伴随衰老相关标志物明显下降：低剂量组腓肠肌SA-β-Gal阳性面积显著低于生理盐水对照，DNA损伤信号标志γH2AX⁺核同样减少，而p21⁺核无显著改变。转录水平上，低剂量显著降低p53与p16表达，p21 mRNA不变；高剂量亦降低p16但对p53作用较弱。SASP相关转录分析进一步支持衰老程序减弱：低剂量COX抑制剂显著降低PAI-1、Igfbp4、IL-6与IFN-γ表达，IL-1β、TNF-α、Ccl2与Ccl8无显著改变；高剂量选择性增加Cxcl10、Timp2与Col3a1表达，同时降低PAI-1。上述结果表明再负荷期间药理学抑制COX-前列腺素信号可改善老年肌肉功能恢复并降低衰老负荷，结合脂质组学/氧化脂质数据，为COX驱动脂质介质活性增强参与衰老骨骼肌衰老负荷与恢复受损提供功能验证。

3.5 Senescent Macrophages Promote COX-2-Dependent PGE2 Production and Induce Myotube Atrophy via Paracrine Signaling：为更好理解COX-前列腺素驱动衰老的细胞机制，研究利用C2C12成肌细胞、RAW 264.7巨噬细胞与NOR-10成纤维细胞建立多柔比星诱导衰老体外模型；这些细胞在骨骼肌恢复、细胞外基质重塑与炎症信号中起关键作用，且随衰老被破坏并易感衰老。多柔比星处理使所有细胞类型SA-β-Gal染色显示的衰老明显增加。随后确定该衰老状态是否与分泌组/SASP中下游COX-2脂质变化相关：PGE₂效应高度依赖细胞类型，C2C12成肌细胞多柔比星处理后PGE₂降低，RAW 264.7巨噬细胞显著增加，NOR-10成纤维细胞无明显变化；提示在所测细胞类型中巨噬细胞是衰老条件下PGE₂产生增加的主要来源。据此后续聚焦RAW 264.7巨噬细胞。多柔比星处理诱导p53与COX-2免疫荧光染色，对照条件几乎无信号，进一步将COX-2来源脂质信号与细胞衰老相联系。为检验该通路在衰老中的功能作用，研究药理学调控COX-2活性：多柔比星显著增加SA-β-Gal阳性细胞比例，COX-2抑制剂NS-398处理可减弱该反应；EP2前列腺素受体激动剂butaprost激活前列腺素信号则增加衰老细胞比例，但程度低于多柔比星。提示单独激活PGE₂信号足以诱导衰老表型，支持COX-2依赖前列腺素信号在巨噬细胞中强化细胞衰老的作用。随后研究这些PGE₂升高的衰老巨噬细胞分泌因子是否影响肌肉细胞：将各组条件培养基（CM）施加于分化C2C12肌管，多柔比星处理巨噬细胞CM较对照CM降低肌管面积，提示肌管萎缩；DOX+NS-398处理巨噬细胞CM部分减轻该效应，但肌管面积未完全恢复至对照；butaprost处理巨噬细胞CM引起与DOX CM相似的肌管尺寸降低。融合指数呈相似反应：DOX处理巨噬细胞CM降低融合能力，DOX+NS-398 CM部分恢复，butaprost处理CM与DOX CM相似且低于对照。综上，衰老诱导巨噬细胞增加COX-2依赖PGE₂产生，并通过其分泌组阻碍肌管尺寸与融合，揭示了连接细胞来源、前列腺素信号增加与肌肉恢复受损的机制。

4 Discussion

本研究通过脂质组学、氧化脂质谱、衰老分析与药理学干预，确定增强且持续的omega-6来源COX信号是衰老肌肉废用后再负荷的核心特征。研究显示衰老与恢复期间PC组成改变及LPC蓄积增加相关，该脂质重塑表型与衰老负荷及SASP表达增加相关；适度COX抑制改善功能恢复并减少衰老与纤维化，尽管肌质量无显著增加。重要的是，老年人肢体固定后也观察到类似年龄相关氧化脂质重塑模式，支持转化相关性。上述数据将持续COX-前列腺素活性定位为脂质重塑、衰老负荷与衰老骨骼肌恢复受损之间的机制联系。衰老恢复反应的关键上游特征是膜磷脂组成改变：膜磷脂不仅是细胞结构成分，也是包括酯化AA在内的生物活性脂质介质前体储库；细胞应激或炎症激活时cPLA2切解释放这些脂肪酸用于下游氧化脂质生成。老年人肌少症肌肉以主要磷脂（包括PC）水平升高为特征，并与肌质量与功能降低相关。与此一致，年轻小鼠肌肉PC含量稳定、脂质介质短暂变化，而老年小鼠肌肉再负荷期间呈持续PC富集、LPC增加及AA优先动员；该模式提示磷脂周转增强与omega-6底物选择性可用，而非PUFA全局释放。鉴于PC是酯化AA的主要储库，该重塑可能使老年肌肉易于下游前列腺素产生放大。值得注意的是，omega-3来源底物未呈可比持续扩增，提示衰老使恢复相关脂质重塑偏向omega-6主导信号；该偏移可能由磷脂池AA动员增加驱动，如老年腓肠肌cPLA2活性与COX-2水平升高所示，并进一步由cPLA2对AA的固有底物偏好强化，促进膜磷脂选择性释放omega-6脂肪酸。与底物偏好一致，靶向氧化脂质谱显示老年小鼠骨骼肌再负荷以omega-6来源脂质介质显著且持续扩增为特征，尤其COX通路相关者；年轻肌肉氧化脂质反应大多短暂，而老年肌肉总氧化脂质早期持续升高，COX来源前列腺素成为主导且最持久的贡献者。该模式值得注意，因为肌肉修复期间脂质介质反应通常短暂并随时间消退，如人类急性抗阻运动后所见。尽管其他脂质通路（包括12-LOX与非酶促氧化产物）在早期再负荷与肌质量呈短暂相关，脂质介质负荷与恢复受损的持续关系在COX通路最一致；提示衰老使协调消退的脂质反应转向持续增强的COX-前列腺素驱动信号。LOX与CYP通路对恢复受损的贡献值得进一步研究，尤其有证据涉及12/15-LOX相关氧化脂质与脂质氢过氧化物在去神经诱导肌萎缩（与肌少症相关过程）中的作用。重要的是，COX活性增强与恢复期间细胞衰老出现紧密相关：老年肌肉衰老细胞负荷在再负荷期间进行性增加，并与肌质量负相关、与COX来源前列腺素及通路活性正相关；编码PGE₂合成–信号轴关键组分的Ptges-1与Ptger1在再负荷期间升高并与衰老及SASP相关转录相关。这些发现支持持续COX-PGE₂信号强化老年肌肉衰老相关程序的模型。此外，脂质介质已被认为在细胞培养与小鼠模型中调节衰老相关信号与免疫监视，支持前列腺素过量可能促进适应不良性重塑而非仅是组织损伤副产物的观点。与此一致，PGE₂已被证明直接促进并维持衰老表型。重要的是，PGE₂支持急性肌肉损伤后卫星细胞增殖与骨骼肌再生；PGE₂在衰老骨骼肌中也有益，老年小鼠抑制PGE₂降解酶15-PGDH可增加肌质量与力量，恢复PGE₂–EP4信号可改善损伤后肌肉干细胞功能与再生。细胞背景差异可能解释这些相反结果，因为卫星细胞介导再生的研究未聚焦巨噬细胞作为PGE₂分泌潜在来源，而本研究强调了后者；该区别在废用后肌肉再生长中可能尤其相关，因为该过程不需要卫星细胞，但巨噬细胞耗竭会损害肌肉再生长。在此框架下，PGE₂信号受严格调控，背景、剂量与时间依赖动态是其功能关键决定因素；短暂局部PGE₂信号促进再生，而本研究支持老年肌肉恢复期间持续或过量PGE₂信号可能反而强化衰老相关通路并损害有效骨骼肌恢复。研究还显示再负荷期间适度药理学抑制COX信号改善老年小鼠恢复：COX抑制改善握力与内在收缩力产生而不增加肌质量，提示改善肌肉质量而非肥大效应；该功能改善伴随纤维化胶原沉积减少及衰老标志物与SASP相关转录减弱。这些发现为COX驱动脂质介质活性增强参与衰老肌肉恢复受损与衰老负荷增加提供机制支持。同时，COX抑制的剂量依赖效应凸显骨骼肌前列腺素生物学的复杂性：前列腺素在某些再生背景可支持有效急性修复，但其效应高度依赖时机、受体使用、COX-1或COX-2偏好及组织背景；高剂量COX抑制剂未改善功能并改变纤维化与炎症转录，强调完全COX抑制可能破坏肌肉重塑。这些结果可能有助于调和既往关于NSAID对肌肉再生影响的差异发现，并强调在衰老组织中调控COX-前列腺素通路时剂量、时机与生理背景的重要性。值得注意的是，老年人抗阻训练期间慢性COX抑制已被显示可增强肌质量与力量，可能通过抑制与肌萎缩相关的PGE₂驱动通路；提示其益处可能依赖背景，并在COX来源信号持续或升高（如衰老中所见）时最明显。重要的是，小鼠中观察到的年龄相关氧化脂质重塑模式在经历肢体固定与恢复的老年人中重现；尽管人类反应动力学较慢、绝对幅度低于临床前模型，老年参与者在恢复期间显示omega-6来源与COX相关通路的优先扩增，而年轻人呈更短暂反应。研究承认小鼠与人类氧化脂质肌肉反应时机并不完全相同，动力学差异可能源于废用方案（后肢卸载 vs. 单侧肢体固定）、取样肌肉（腓肠肌 vs. 股外侧肌活检）及两物种肌肉恢复速率不同；尽管存在这些差异，临床前与临床数据集的汇聚强化了持续前列腺素信号作为衰老恢复受损标志的转化意义。数据还确定巨噬细胞是参与该机制的潜在细胞来源：COX-2表达已在再生人类骨骼肌CD68⁺巨噬细胞中定位。