《American Journal of Medical Genetics Part A》：De Novo Balanced Chromosomal Translocations Separate Intact FOXF1 From Its Distant Lung-Specific Enhancer in Lethal Alveolar Capillary Dysplasia
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肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位（ACDMPV）是一种罕见的致死性肺发育障碍性疾病，由16q24.1染色体上的FOXF1基因单倍剂量不足引起。遗传学研究显示，在经组织病理学确诊的ACDMPV患者中，80%-90%存在涉及FOXF1或其上游约324 kb处约66
肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位（ACDMPV）是一种罕见的致死性肺发育障碍性疾病，由16q24.1染色体上的FOXF1基因单倍剂量不足引起。遗传学研究显示，在经组织病理学确诊的ACDMPV患者中，80%-90%存在涉及FOXF1或其上游约324 kb处约660 bp超保守肺特异性增强子的杂合点突变或拷贝数变异缺失。研究人员利用短读长全基因组测序（WGS）结合人工智能平台，重新检测了两例既往经Sanger测序和染色体微阵列分析检测为阴性的未解决ACDMPV病例。对一例14年存档尸检肺组织福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本的WGS分析表明，存在一条明显的平衡新生易位t(10;16)(q26.2;q24.1)，其16号染色体断裂点位于完整FOXF1上游11 kb处，破坏了FOXF1邻近的长链非编码RNA（lncRNA）FENDRR，而10号染色体断裂点位于DOCK1的3'UTR内。在一个无亲缘关系的三人核心家系中，对新鲜冷冻尸检肺标本的WGS研究发现了一条新生平衡易位t(3;16)(q29;q24.1)，其16号染色体断裂点位于完整FOXF1上游约211 kb处，破坏了lncRNA LINC01081，而3号染色体断裂点位于TFRC内部。Sanger测序证实这些均为平衡易位，且在父母血液中未发现体细胞嵌合体证据。对患者2新鲜冷冻肺组织提取RNA进行的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析显示，FOXF1、FENDRR和TMEM100的表达显著降低。这些数据表明，在未进行核型分析的情况下，检测断裂点位于远离完整致病基因的非编码基因组区域的平衡染色体畸变存在诊断挑战。这些案例展示了人工智能辅助WGS再分析在先前未解决病例中优先筛选候选结构变异的潜在应用价值。
研究背景与科学问题
肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位（ACDMPV）是一种罕见且致命的先天性肺发育障碍疾病，新生儿通常在出生后数小时内出现不可逆的呼吸窘迫和严重肺动脉高压，多数患儿于出生后一个月内死亡。其组织病理学特征包括肺泡毛细血管密度减少、肺泡壁增厚、小肺动脉明显中层肥厚以及肺静脉错位。既往遗传学研究已在80%-90%经组织病理学确诊的ACDMPV患者中，鉴定出位于16q24.1染色体区域的间充质叉头框转录因子FOXF1基因的杂合功能丧失性突变，或包含FOXF1上游约324 kb处约660 bp超保守肺特异性增强子的拷贝数变异（CNV）缺失。然而，仍有约10%-20%的患者通过常规Sanger测序和染色体微阵列分析（CMA）未能检出致病突变。由于核型分析在ACDMPV婴儿中极少开展，平衡性染色体畸变作为一类潜在的致病机制一直难以被常规一线遗传学检测所识别。此前仅有少数个案报道，包括一例pericentric inversion inv(16)(p11.2q24.1)和一例de novo translocation t(1;16)(q32;q24.1)，其16号染色体断裂点均位于FOXF1上游的非编码序列区域。因此，对于这些常规检测阴性的疑难病例，亟需更先进的基因组技术手段来探索其潜在的遗传病因。
研究方法概述
研究人员采用短读长全基因组测序（WGS）技术，对两例临床和组织病理学确诊ACDMPV但前期遗传学检测阴性的患者进行了回顾性分析。患者1为14年前存档的尸检肺组织福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本，在AiLife公司完成30×覆盖度的WGS；患者2及其父母构成三人核心家系，其新鲜冷冻尸检肺标本在Novogene公司通过HiSeqX平台完成30×覆盖度的WGS三人家系测序。FASTQ文件分别采用Gamow Labs定制软件和基于人工智能的Lucid Genomic平台进行分析，同时使用Manta（v1.6.0）进行结构变异（SV）检测，并在Integrative Genomics Viewer（IGV）中对断点区域的异常配对读段和分裂读段比对结果进行人工核查。所有预测的断点区域最终通过Sanger测序验证。此外，对患者2的新鲜冷冻肺组织RNA进行了逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），检测FOXF1、FENDRR和TMEM100的表达水平。
研究结果
4.1 肺组织病理学
患者1的肺组织虽出现早期自溶改变，但仍可辨认出ACDMPV的特征性结构异常：细支气管旁的小肺动脉呈现轻至中度肌层增厚，异常肌化延伸至通常无肌层的肺泡壁小血管，许多动脉和新近肌化的血管伴有扩张淤血的静脉，正常肺泡毛细血管罕见，取而代之的是薄壁扩张的血管结构。患者2的尸检肺组织显示严重的肺实质发育不良，肺泡间隔增宽，中央毛细血管稀少，肺泡化不足，肺小动脉分支和实质小动脉严重中层肥厚，支气管血管束内常见与肺动脉分支密切相伴的薄壁血管通道（即所谓的错位肺静脉）。
4.2 Sanger测序和染色体微阵列分析
对两名患者的FOXF1编码区进行Sanger测序以及对患者1进行CMA均未检出致病性变异。
4.3 全基因组测序
定制软件和AI平台共同揭示了两个看似平衡的相互易位事件。患者1携带一条新生平衡易位t(10;16)(q26.2;q24.1)：der(16)染色体断点精确定位于chr16:86,499,524，恰在完整FOXF1上游11 kb处，位于lincRNA FENDRR的内含子1内；der(10)染色体断点位于chr10:127,452,017，处于DOCK1的3'UTR尾部，连接处存在1 bp（A）的微同源序列。患者2携带一条新生平衡易位t(3;16)(q29;q24.1)：der(16)染色体断点位于chr16:86,299,495，位于FOXF1与其肺特异性增强子之间，距离完整FOXF1上游约211 kb，破坏了lncRNA LINC01081；der(3)染色体断点位于chr3:196,069,391，处于TFRC基因的3'端内部，连接处分别存在1 bp（T）和2 bp（TC）的微同源序列。父母血样PCR检测均未发现体细胞嵌合体证据。患者2的一个信息性SNP提示该易位可能源自父源16号染色体的新生事件。
4.4 逆转录定量聚合酶链反应
对患者2新鲜冷冻肺组织RNA的RT-qPCR分析显示，与年龄匹配的正常对照相比，FOXF1、其下游靶基因TMEM100以及lncRNA FENDRR的表达水平均显著降低，这一表达谱变化模式与既往已报道的携带FOXF1或其增强子CNV缺失的ACDMPV患者一致。
讨论与结论
本研究报告的两例ACDMPV患者中，16号染色体的断点均将完整的FOXF1基因与其远端的肺特异性增强子分离开来，这种空间分离很可能改变了三维染色质构象，破坏了增强子-启动子之间的正常相互作用，从而导致FOXF1及共调控的FENDRR表达下调。患者1的断点位于FENDRR内含子内，尽管单纯FENDRR缺失尚未被确认为ACDMPV的独立病因，但由于FOXF1和FENDRR共享同一个远端肺特异性增强子，该增强子的缺失已被证实会导致这两个基因表达下降。患者2的断点位于FOXF1与增强子之间的约211 kb区域内，并破坏了LINC01081。两个易位涉及的另一个染色体断点分别位于DOCK1和TFRC基因内，但这两个基因均不属于剂量敏感基因，其破坏不太可能导致表型贡献。
本研究扩展了与ACDMPV相关的遗传结构变异谱系，进一步支持平衡性基因组重排可通过扰乱FOXF1和FENDRR的调控机器而产生完全的ACDMPV表型的观点。研究数据突显了在通常不进行核型分析的临床场景下，检测断裂点位于远离致病基因的非编码基因组区域的平衡染色体畸变所面临的诊断挑战。此外，这两例易位的断点均位于靠近染色体末端的亚端粒区域，这类隐匿性末端重排即使通过常规核型分析也难以检测。尽管光学基因组图谱（OGM）和长读长测序是检测此类重排的替代方案，但在ACDMPV病例中常因仅有FFPE肺组织标本可用而无法获得足够高质量的DNA。在本研究中，人工智能辅助的再分析帮助优先筛选出了传统结构变异检出程序产生的候选断点，展示了AI辅助候选变异优先排序的潜在应用价值。
