间充质基质细胞介导的溶瘤细菌肿瘤靶向递送联合免疫检查点阻断治疗黑色素瘤

《MedComm》：Mesenchymal Stromal Cells-Mediated Tumor-Targeted Delivery of Oncolytic Bacteria Combined With Immune Checkpoint Blockade Against Melanoma

溶瘤细菌疗法因其肿瘤靶向能力与免疫微环境激活作用，在肿瘤治疗中具有巨大应用潜力。然而，溶瘤细菌的严重不良反应限制了其临床应用。在保持溶瘤细菌疗效的同时提高其生物安全性，对于推进活体微生物肿瘤治疗的临床转化至关重要。本研究构建了间充质基质细胞（MSC）介导的鼠伤寒沙门菌VNP20009肿瘤靶向递送系统（MSC-VNP），显著增强了VNP的瘤内富集与安全性。该优势源于MSC的肿瘤归巢趋化性以及胞内VNP的延迟释放。为提升治疗效果，研究人员构建了可持续分泌PD-1纳米抗体（PD1nb）的工程化MSC（MSC-PD1nb），并与MSC-VNP联合用于黑色素瘤治疗。该联合疗法在小鼠黑色素瘤模型中通过增加抗肿瘤效应细胞（CD8+ T效应细胞）并减少促肿瘤效应细胞（CD4+ T调节细胞）而提高抗肿瘤疗效。上述数据表明，MSC介导的联合免疫治疗提供了一种有前景的抗肿瘤免疫策略，为拓展溶瘤细菌在肿瘤治疗中的应用前景提供了依据。

研究背景与立项依据

肿瘤微环境（TME）对常规免疫治疗构成关键屏障，包括T细胞浸润受损与显著的免疫抑制信号。因此，针对单一效应靶点（如PD-1/PD-L1等免疫检查点阻断剂，ICB）的治疗难以完全清除肿瘤。溶瘤细菌因其优先定植于缺氧肿瘤并激活抗肿瘤免疫的能力而成为有前景的策略，其中减毒鼠伤寒沙门菌VNP20009（VNP）具有较强抗肿瘤活性，但因其显著毒性与脱靶效应，其I期临床试验已被终止。已有研究通过聚多巴胺、海藻酸盐、细胞膜等包覆菌株表面进行伪装以增强生物相容性，但细菌增殖导致修饰层脱落仍存在安全隐患。细胞载体系统（如中性粒细胞、巨噬细胞）虽可平衡VNP安全性与疗效，但来源有限、免疫排斥及炎症因子风暴限制其临床应用。间充质基质细胞（MSC）具有低免疫原性、来源丰富、良好趋化性及强肿瘤归巢能力，且既往研究显示移植表达单克隆抗体的工程化MSC（MSC-mAbs）可体内持续分泌抗体并维持更稳定的血清抗体水平。据此，研究人员假设MSC介导的VNP肿瘤靶向递送（MSC-VNP）可借助MSC肿瘤归巢特性、在浸润肿瘤后控制胞内菌株释放，从而减少直接给药的不良反应；同时构建分泌PD-1纳米抗体（PD1nb）的工程化MSC（MSC-PD1nb）以持续分泌PD1nb增强疗效。由于皮下肿瘤较原位肿瘤更难被细胞载体到达，本研究选择皮下接种黑色素瘤模型进行验证。该研究首次提出MSC介导的VNP递送系统，兼顾VNP安全性与抗肿瘤疗效，并进一步联合MSC-PD1nb显著增强黑色素瘤模型的治疗效果。

主要关键技术方法

研究采用人脐带来源MSC细胞系、MSC-EGFP细胞系、RAW264.7小鼠巨噬细胞、B16F10小鼠黑色素瘤细胞、293T人胚肾细胞系、HGC-27人胃癌细胞及A549人肺癌细胞（均来自实验室存档）；人脐带来源MSC研究经南京鼓楼医院研究伦理委员会批准（批准号2017–161-01），供者均签署书面知情同意。动物实验采用C57BL/6J小鼠（6–8周，雌性）右侧腹皮下接种B16F10细胞建立黑色素瘤模型，经南京鼓楼医院实验动物中心动物伦理委员会批准（批准号2022AE01040）。关键技术包括：共培养制备VNP负载MSC（MSC-VNP）并以庆大霉素清除胞外菌；荧光显微镜与透射电镜（TEM）观察胞内载菌；流式细胞术（FACS）检测载菌效率及免疫细胞浸润；Transwell趋化实验与细菌释放实验；活细胞成像系统及活体原位细胞动态成像系统（IVIM）追踪分布；尾静脉给药评估生物分布、安全性（体重、脾重、AST/ALT、CRP、Treg、H&E）与抗肿瘤疗效（肿瘤体积、瘤重、生存曲线、凋亡染色）；电穿孔构建并以G418筛选MSC-PD1nb，ELISA与Western blot验证PD1nb分泌；定量实时PCR；统计学采用t检验或单因素方差分析。

研究结果

2.1 人MSC可作为VNP的细胞载体：共培养并以庆大霉素清除胞外VNP后，荧光显微镜、TEM及流式细胞术均证实MSC成功内载VNP；在感染复数（MOI）100、无血清共培养条件下获得较高包封效率，共培养1 h载菌效率约114株/100细胞且细胞存活率>90%；胞内菌株活性与未处理游离VNP相当，液氮冻存后MSC-VNP仍保持良好细菌增殖与细胞活力，VNP抗肿瘤效力未受损。研究还发现MSC对灭活VNP不能包封，提示载菌主要依赖细菌感染细胞而非细胞主动吞噬。

2.2 MSC-VNP的表征：Transwell实验显示载菌后MSC对B16F10、HGC-27及A549肿瘤细胞的趋化能力未受影响；利用表达红色荧光蛋白的VNP-DsRed实时监测发现VNP于9 h开始延迟释放、18 h完全释放，平板计数结果一致；释放的VNP可有效诱导肿瘤细胞凋亡，且在模拟肿瘤微环境（低pH与缺氧）下生长曲线与抗肿瘤效力与野生型VNP相当。

2.3 MSC-VNP促进VNP在肿瘤内浸润与增殖：示踪实验显示MSC-EGFP在移植后18 h即浸润实体瘤，同时可见VNP瘤内定植，48 h瘤内VNP显著增多；与游离VNP相比，MSC-VNP释放的VNP优先富集于肿瘤核心，两组的VNP最终均于给药后2周被免疫细胞清除；IVIM显示MSC-VNP组18 h时VNP-DsRed已见于黑色素瘤组织，而VNP组仍滞留于血管内；免疫荧光、流式及平板计数显示MSC-VNP组脾、肾、肺、心、肝等正常器官中VNP显著少于直接给药组，而组间瘤内细菌滴度无显著差异。结论为MSC-VNP的核心优势在于更早的肿瘤核心富集与更低的脱靶毒性。

2.4 MSC-VNP较直接VNP给药显著降低生物毒性：健康小鼠尾静脉给药后第3天，MSC-VNP组显著消除了单用VNP引起的快速体重下降与脾肿大，AST、ALT升高显著减轻，脾与肝组织病理损伤减少；单用VNP引起的CRP与外周血Treg上调在MSC-VNP组不再出现；VNP注射组有3只小鼠死亡，而MSC-VNP组全部存活。第14、28天评估显示单用VNP所致体重下降与脾肿大逐渐缓解，至第28天各治疗组均未检测到长期毒性或免疫毒性，VNP已从各器官清除。

2.5 MSC-VNP有效抑制B16F10肿瘤生长：单用MSC注射无抗肿瘤效果；单用VNP显著抑制黑色素瘤进展，较PBS与MSC注射组肿瘤体积减少36.2%；MSC-VNP同样显著阻断肿瘤进展，但与VNP组间无显著差异；给药后第7天MSC-VNP组瘤重仅为生理盐水组的35.4%；MSC-VNP显著延长生存时间；H&E显示MSC-VNP或单用VNP组肿瘤坏死区域更多，两组均见明显凋亡且凋亡区域与VNP定植区域对应，提示抗肿瘤作用部分源于VNP对肿瘤细胞的裂解活性。

2.6 MSC-PD1nb协同增强抗肿瘤疗效：构建含EF-1a启动子与信号肽序列的pcDNA3.1质粒并经电穿孔导入MSC，筛选获得20株可分泌识别PD-1蛋白的PD1nb的MSC克隆，分泌浓度23.1–228.5 ng/mL，Western blot证实纳米抗体大小为14 kDa，选取第18号克隆用于后续实验，且PD1nb分泌水平在传代中保持稳定。在黑色素瘤模型中，MSC-VNP+MSC-PD1nb组抗癌效果最为显著，第7天瘤重仅为MSC-VNP+PD1nb组的67.7%，这与工程化MSC-PD1nb可肿瘤靶向并在存活时表达分泌PD1nb、使瘤内PD1nb水平高于易被降解的单纯混合PD1nb有关；该组肿瘤细胞凋亡更明显、坏死区域更广泛，除生理盐水组外各组均有效抑制肿瘤细胞增殖，瘤内免疫细胞数量显著增加。进一步以非肿瘤靶向细菌对照（大肠杆菌及灭活VNP）及序贯给药（MSC-VNP后3天给予MSC-PD1nb）比较，非靶向细菌组虽血清IL-6、IL-10显著升高但未能获得相当疗效，而MSC-VNP组肿瘤抑制显著更优；序贯给药组抗肿瘤活性最强，瘤体积与瘤重最小、中位生存最长。结论为MSC-VNP通过肿瘤特异性机制而非非特异性全身免疫刺激发挥疗效，序贯给药为最佳方案。

2.7 MSC-VNP与MSC-PD1nb激活肿瘤免疫微环境：流式细胞术显示基于MSC-VNP的治疗后巨噬细胞浸润率较生理盐水组显著增加（分别为1.46倍与1.17倍），具有抗肿瘤活性的M1样巨噬细胞比例显著升高、免疫抑制性M2样巨噬细胞比例下降，M1/M2比值升高（分别为1.46倍与1.17倍）；树突状细胞（DC）水平较生理盐水组显著增加6–10倍。肿瘤浸润CD4⁺ T细胞比例各组间无显著变化，而协同MSC-PD1nb治疗组CD8⁺ T细胞浸润显著高于生理盐水、MSC-VNP及MSC-VNP+PD1nb组；该组瘤内Treg细胞（CD4⁺FOXP3⁺细胞）比例较生理盐水、MSC-VNP及MSC-VNP+PD1nb组分别下降88.3%、82.5%与61.2%，脾脏亦见类似现象，但脾脏CD8⁺ T细胞及IFN⁺CD8⁺ T细胞未见增加，可能与MSC分泌的PD1nb主要富集于肿瘤而非脾脏有关。结论为MSC介导的瘤内VNP增殖与PD1nb富集不仅显著耗竭免疫抑制性M2样巨噬细胞与Treg细胞，还显著增加抗肿瘤M1样巨噬细胞、DC及细胞毒性CD8⁺ T细胞比例，逆转免疫抑制性肿瘤微环境。

讨论与结论

讨论指出，临床试验中溶瘤细菌经静脉直接给药使细菌立即暴露于免疫系统，一方面触发快速免疫激活而被迅速清除，另一方面其肿瘤富集主要依赖厌氧环境中的增殖而非主动靶向，导致部分菌株随机分布于正常器官引起炎症病变，VNP在肉瘤静脉治疗I期试验中即因严重不良反应而终止。MSC介导的VNP递送系统通过三方面应对上述挑战：MSC包裹VNP屏蔽其免疫暴露，显著下调体内CRP与Treg水平以减轻炎症反应；MSC固有肿瘤靶向能力促进菌株更早渗透肿瘤组织；MSC肿瘤归巢能力显著减少VNP在肝、脾、肺等脱靶器官的分布，从而有效防止直接给药相关组织损伤，显著降低急性不良反应发生率与相关死亡率。与免疫细胞载体相比，MSC来源更易获得、体外易培养且增殖迅速，低MHC表达使同种异体输注免疫排斥极小，可降低细胞治疗成本；与既往胞内负载传统抗癌药物需注射大量细胞（10⁷–10⁸）不同，本研究以MSC递送"活"药物，5×10⁵ MSC-VNP即可有效治疗肿瘤，仅需传统细胞治疗细胞量的1/100，且该系统具有模块化特点，可替换为其他溶瘤细菌。研究还指出，皮下肿瘤免疫细胞浸润困难、细胞载体更难到达，而该体系仍表现出优异的黑色素瘤靶向能力，提示在原位肿瘤中靶向性可能更强，并适用于转移性肿瘤与术前辅助治疗。针对ICB治疗后药物在正常器官蓄积引起不良反应的问题，工程化MSC-PD1nb使PD1nb产生集中于瘤内，通过阻断PD-1/PD-L1相互作用逆转T细胞耗竭，激活肿瘤CD8⁺ T细胞并抑制Treg细胞分化，疗效优于PD1nb与MSC-VNP联合。研究同时承认未直接分析瘤内T细胞耗竭标志物（PD-1、TIM-3）及IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞为局限，未来将纳入这些分析以进一步阐明机制。与既往主要利用VNP表达PD1nb不同，哺乳动物细胞表达系统可完成糖基化等翻译后修饰，避免原核系统的内毒素污染与包涵体形成风险，降低免疫原性，因此编程MSC表达PD1nb可能是更优替代方案。研究亦指出胞内负载微生物释放的不确定性是细胞递药系统的共同挑战，正在开发利用酸性TME的pH响应性细菌释放开关以实现时空可控的VNP逃逸。

研究结论为：本研究首次证明MSC可作为"特洛伊木马"与抗肿瘤抗体生产者，协助VNP菌株在肿瘤内蓄积并持续释放抗肿瘤抗体，协同实现更佳抗癌疗效；该系统通过限制细菌异源刺激提高了溶瘤细菌肿瘤治疗的生物安全性与生物相容性；MSC介导的VNP递送与抗肿瘤抗体产生系统可能为细胞介导与微生物介导的抗肿瘤治疗开辟新策略。