基于非靶向与靶向质谱联用策略从铁轴草中发现具有铁死亡抑制活性的松香烷型二萜化合物

《Chemistry & Biodiversity》：Ferroptosis Inhibitory Abietane Diterpenoids from Teucrium pilosum Discovered Using Integrated Untargeted and Targeted Mass Spectrometry Strategies

采用整合的非靶向与靶向筛选方法——全球天然产物社会分子网络（GNPS）和串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS），对铁轴草（Teucrium pilosum）进行了植物化学研究。由此分离并鉴定了三个新的松香烷型二萜类化合物（teucosums A–C，1–3）以及15个已知类似物（4–18）。通过全面的光谱学分析（高分辨电喷雾电离质谱 HR-ESI-MS、一维/二维核磁共振波谱 1D/2D NMR）、电子圆二色谱（ECD）和单晶X射线衍射，明确阐明了它们的结构，包括绝对构型。所有分离得到的化合物均评估了其对HT-22细胞中RSL3诱导的铁死亡（ferroptosis）的抑制效果。值得注意的是，化合物1–4、6、7、9–11、13和15–18表现出显著的抗铁死亡活性。这些发现不仅丰富了松香烷型二萜的化学多样性，也凸显了铁轴草作为潜在铁死亡抑制剂来源的前景。

研究背景与研究目的

铁死亡（ferroptosis）是一种新近发现的、依赖细胞内铁离子积累导致脂质过氧化物堆积的程序性细胞死亡形式，其在形态、生化及遗传特征上均区别于经典的凋亡、坏死和自噬。越来越多的证据表明，铁死亡与神经退行性疾病、脑血管硬化及脑肿瘤等疾病的发生发展密切相关。因此，寻找高效低毒的铁死亡抑制剂对于上述疾病的治疗具有重要意义。此前的研究发现，松香烷型二萜类化合物（abietane-type diterpenoids）在抑制神经元细胞铁死亡方面展现出优异活性，最佳半数效应浓度（EC₅₀）可达56纳摩尔级别。然而，如何快速高效地从天然产物中发现此类活性成分仍是亟待解决的问题。

铁轴草（Teucrium pilosum）隶属于唇形科香科科属，在中国西南地区民间常用于治疗风热感冒、咽喉肿痛等炎症性疾病。尽管该属植物富含二萜类次生代谢产物，但针对铁轴草的化学成分及其生物活性研究十分有限。为此，研究人员开展本研究，旨在利用先进的质谱导向策略，系统挖掘铁轴草中具有铁死亡抑制活性的松香烷型二萜化合物。

研究方法与技术路线

本研究采用了创新的整合非靶向与靶向质谱筛选策略。首先，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）采集数据，并借助全球天然产物社会分子网络（GNPS）平台进行分子网络聚类分析，结合计算机预测工具SIRIUS 4对铁轴草提取物中的化学成分进行初步注释。随后，基于已知化合物的二级质谱裂解规律，鉴定出特征诊断离子（diagnostic ions）m/z 243.06和m/z 259.09。利用这些特征离子对石油醚层和乙酸乙酯层的质谱数据进行再筛选，结合自主研发的代码过滤和GNPS重分析，锁定目标离子峰。最终，通过常规柱层析（硅胶、ODS反相柱、Sephadex LH-20）和半制备高效液相色谱（semi-preparative HPLC）进行定向分离纯化。化合物的结构确证综合运用了高分辨质谱（HR-ESI-MS）、一维/二维核磁共振波谱（1D/2D NMR）、电子圆二色谱（ECD）计算以及单晶X射线衍射技术。植物材料于2022年7月采自中国贵州省安龙县。

研究结果

2.1.1 筛选阶段的构建与注释

研究人员首先进行GNPS聚类，并结合SIRIUS 4等质谱预测工具确定目标离子的近似簇位置。通过集成GNPS LC-MS仪表板进一步定位目标离子在液相色谱中的保留时间窗口，从而推断其可能存在于正相或反相馏分中，指导后续的定向分离。

2.1.2 非靶向筛选阶段

初始非靶向筛选中，LC-MS分析与GNPS分子网络及SIRIUS 4联合应用，实现了对铁轴草化学成分的全面轮廓分析。分子网络显示大量松香烷型二萜的存在。基于预测和聚类结果，对前体离子m/z 359.148进行追踪，最终通过半制备HPLC分离得到目标代谢物teuvincenone A（5），并以此为探针，进一步鉴定出化合物4、6、9、10和13。

2.1.3 靶向筛选阶段

通过对已知化合物4–6、9、10和13的MS²谱图分析，确定了导致特征离子m/z 243.06和m/z 259.09的碎裂途径。利用这两个诊断离子对石油醚层和乙酸乙酯层数据进行重新筛选，并通过MZmine 3处理原始数据，将选定特征的保留时间映射到相应的反相馏分进行靶向分离，最终获得了多个化合物。新化合物1–3的MS²谱图也证实了这两种诊断离子的存在。

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  Teucosum A（1）：淡白色油状物，分子式C₂₀H₂₄O₅。其结构为一种17(15→16)-abeo-松香烷型二萜，与已知化合物15,16-dihydrouncinatone（13）相似，主要区别在于化合物1中少了一个双键。通过NOESY实验和ECD计算，确定其绝对构型为3S,4R,5S,10R,16S。
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  Teucosum B（2）：黄色晶体，分子式C₂₀H₂₀O₅。其结构与已知化合物teuvincenone E（6）高度相似，主要差异在于C-15和C-16之间存在一个额外的双键。通过单晶X射线衍射分析，明确其绝对构型为5S,10S。
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  Teucosum C（3）：黄色晶体，分子式C₂₀H₂₀O₄。其NMR数据与化合物2非常接近，表明它们共享相同的碳骨架。区别在于化合物3缺少一个酮羰基，并多了一个末端双键。通过单晶X射线衍射分析，确定其绝对构型为5S,10R。

此外，还鉴定出15个已知的松香烷型二萜化合物（4–18）。

铁死亡活性评价与结构-活性关系

所有18个化合物均在HT-22细胞中评估了对RSL3诱导铁死亡的抑制作用，以Fer-1作为阳性对照。结果显示，除化合物5、8、12和14外，其余14个化合物在20微摩尔浓度下均表现出显著活性。其中，化合物1–4、7、9–11、13、15和18的EC₅₀值介于0.255至2.479微摩尔之间，而阳性对照Fer-1的EC₅₀值为0.030微摩尔。结构-活性关系分析表明，C-12和C-13位形成含氧五元环并带有C-16甲基取代的结构单元通常能增强抑制活性；反之，缺失该环则活性降低。此外，即使在含有此环的类似物中，在C-2或C-3位引入羰基，或在C-15与C-16之间引入双键，也可能降低活性。其中，化合物10的活性最强（EC₅₀ = 0.255 ± 0.077微摩尔），提示其可能是发挥保护作用的主要贡献者。

研究结论

总之，通过采用非靶向扫描与靶向扫描相结合的策略，研究人员从药用植物铁轴草中分离并鉴定了三个新的松香烷型二萜化合物及十五个已知化合物。这些发现极大地丰富了松香烷型二萜的化学多样性，并进一步证明了该非靶向与靶向扫描策略在快速高效发现天然产物方面的潜力。更令人鼓舞的是，这些化合物中的大部分对RSL3诱导的HT-22细胞铁死亡表现出强效抑制活性。这项工作为进一步开发铁死亡抑制疗法奠定了基础。