《Clinical and Translational Science》：Single-Cell Transcriptomic Landscape of the Human Discoid Meniscus: Identification of Candidate Cell States and Transcriptional Programs
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盘状半月板是一种半月板形态发育异常，正常半月板呈"C"形覆盖胫骨平台，而盘状半月板则宽而厚。其在亚洲人群中的患病率（15%–20%）高于美国人群（3%–5%）。尽管大多数患者无症状，但盘状半月板组织比正常半月板组织更易发生损伤，患者可出现交锁、疼痛、肿胀或打软
盘状半月板是一种半月板形态发育异常，正常半月板呈"C"形覆盖胫骨平台，而盘状半月板则宽而厚。其在亚洲人群中的患病率（15%–20%）高于美国人群（3%–5%）。尽管大多数患者无症状，但盘状半月板组织比正常半月板组织更易发生损伤，患者可出现交锁、疼痛、肿胀或打软腿等症状，诊断通常需借助磁共振成像。目前，研究人员对盘状半月板的发病机制与病理生理学认识仍然有限。本研究利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）分析了4例盘状半月板（包括3例外侧盘状半月板DLM和1例内侧盘状半月板DMM）与3例对照半月板样本，揭示了两组在细胞类型和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成上的差异。研究结果表明，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）与缺氧诱导因子1α（HIF1A）信号通路的激活以及Wnt信号通路的失活，可能与该队列中盘状半月板与对照样本之间观察到的转录组差异相关。SCX被鉴定为盘状半月板相关软骨细胞样群体中富集的候选转录调控因子。鉴于对照组存在年龄与骨关节炎状态的混杂效应，上述发现应被解释为探索性、假设生成性的结果，并为未来验证研究提供参考资源。
盘状半月板（discoid meniscus，DM）是半月板形态发育异常：正常半月板呈"C"形覆盖胫骨平台，DM则宽而厚。其在亚洲人群患病率约10%–15%，高于美国人群的3%–5%，外侧DM（DLM）发病率（1.2%–5.2%）高于内侧DM（DMM，0.12%–0.3%）。多数患者无症状，但DM组织比正常半月板更易发生损伤，可出现交锁、疼痛、肿胀；目前研究人员对其发病机制与病理生理学的认识仍十分有限。既往scRNA-seq研究因细胞数量有限仅能鉴定软骨细胞，且未能纳入DMM，DM的细胞异质性、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）特征与调控程序尚未阐明。为此，研究人员对4例DM标本（3例DLM、1例DMM）和3例非盘状对照半月板（CM）行scRNA-seq，共获得58,482个细胞（CM 26,370个、DM 32,112个），系统刻画了DM的细胞组成、ECM相关转录模式与候选调控程序，并鉴定出SCX为DM相关未成熟样软骨细胞程序富集的候选转录因子，为理解DM发病机制提供了转录组资源。
关键技术方法：研究人员采用10× Genomics微滴式scRNA-seq平台测序，经Cell Ranger比对、Seurat质控（剔除基因数<300或线粒体比例>20%的细胞）与Harmony整合后，以UMAP（uniform manifold approximation and projection，降维可视化方法）聚类和FindAllMarkers（p<0.05且|log2FC|>0.25）鉴定标志物；利用Ro/e（observed-to-expected ratio，观察值与期望值之比，衡量细胞群分布偏好的指标）分析细胞群分布偏好，ssGSEA行通路富集，scFEA（single-cell flux estimation analysis，单细胞代谢通量解析方法）解析ECM相关代谢通量，Monocle2构建拟时序轨迹（q-val<10
?5），CytoTRACE评估细胞干性，SCENIC构建转录调控子（regulon，转录因子及其靶基因）网络。样本来源于4例行关节镜部分半月板切除术的症状性DM患者（3例DLM、1例DMM）及3例因膝骨关节炎行全膝关节置换术的CM患者。并以组织qRT-PCR、Western blot、免疫组化及C28/I2软骨细胞SCX过表达/敲低进行验证。
3.1 盘状半月板的单细胞转录组分析：基于经典标志物基因鉴定出软骨细胞（ACAN
+、COMP
+）、内皮细胞、髓系细胞、B细胞、T细胞、周细胞和成纤维细胞7种主要细胞类型。DM中软骨细胞比例更高、髓系细胞比例更低，T细胞仅在CM中检出；Ro/e分析验证了这一分布偏好，与DM血管较少、损伤后愈合能力较差的报道一致。
3.2 DM与CM软骨细胞亚群组成的差异：将软骨细胞分为调节性软骨细胞（RegC，CHI3L2
+、CHI3L1
+）、修复性软骨细胞（RepC，CILP
+、OGN
+）、稳态软骨细胞（HomC）、前肥大软骨细胞（preHTC）、纤维软骨细胞（FC）、软骨祖细胞（cartilage progenitor cells，CPC）和增殖软骨细胞（ProC）7个亚型。DM中RegC、RepC、HomC比例更高，CM中preHTC、FC、ProC更多（FC为著）；转录因子SOX9在RegC、RepC、HomC和ProC中表达，且在DM中显著升高、DMM中最高。
3.3 细胞外基质差异可能使DM更易损伤：七种软骨细胞亚型呈两类ECM表达模式：RegC、RepC、HomC高表达ACAN，FC高表达VCAN及I型胶原基因（COL1A1、COL1A2），RepC高表达II型胶原基因（COL2A1）；scFEA显示透明质酸合成在preHTC群体且在CM中显著上调。CM中PRG4（编码润滑素lubricin）显著高于DM，DM中抗血管生成基因THBS1（编码TSP1）、CNMD（编码ChM-I）表达升高，与DM血管化降低、愈合能力差相关。
3.4 DM中软骨细胞呈现更高的未成熟性与增殖能力：CytoTRACE与Monocle2分析表明ProC与CPC分化潜能最高、preHTC与FC最低，DM软骨细胞处于相对未分化状态。全队列中DM的HIF-1、BMP结合、TGF-β及软骨发育相关基因集评分更高而WNT相关评分更低；但排除单一DMM供体后TGF-β差异方向反转，故TGF-β结果仅作描述性观察，不支持一致的DM相关通路改变或WNT拮抗作用。
3.5 SCX是DM未成熟样软骨细胞程序的候选调控因子：SCENIC显示RegC、RepC、HomC具有以SOX9、SOX6为核心的高活性regulon网络，各亚型另有独特网络（如FC中GLI1高活性）。Monocle2将拟时序依赖基因分为四个表达簇，SCX与SOX9表达模式高度一致，且SCX主要富集于DM、在CM中几乎不表达并高度相关于软骨发育，提示DM存在SCX
+/SOX9
+双阳性未成熟样软骨细胞群体。
3.6 DM中破骨细胞相关与血管生成相关程序被激活：DM中破骨样细胞（CTSK
+、ACP5
+）比例升高且破骨细胞发育信号富集；CM中VEGFA、VEGFB、PDGFA更高，DM中血管成熟稳定相关基因ANGPT1、ANGPT2更高且血管生成信号通路被激活，提示潜在代偿性调控特征。
3.7 正交组织与SCX扰动实验：qRT-PCR显示DM中ID1、VEGFA、AXIN2更高而GLUT1、SMAD6、DKK1更低；Western blot显示p-SMAD1/5、HIF1α、p-β-catenin、PDK1升高而总β-catenin、SMAD6、DKK1降低。C28/I2细胞中SCX过表达与敲低产生相反变化，表明SCX可调控所测指标但不能证明其导致DM状态；免疫组化因仅1例DM供体仅作描述性呈现。
讨论与结论：本研究系统表征了DM与正常半月板的细胞组成及ECM差异：DM以RegC、RepC、HomC比例升高伴FC比例降低为主要特征，伴随sGAGs、胶原及PRG4、THBS1等基因表达差异，可能是DM易损伤的原因之一。SCX作为肌腱发育主调控因子，与SOX9在发育过程中交互调控，SCX/SOX9双阳性细胞与未成熟样成软骨状态相关，提示该转录程序可能参与DM表型；未来可结合全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）与全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）等探索遗传易感因素。研究存在队列小、年龄与骨关节炎状态混杂、正交验证有限等局限。研究结论认为，本研究刻画了盘状半月板的细胞与分子特征，为理解其发病机制提供了线索，相关发现需在更大年龄匹配队列和实验系统中验证。
